肢体后适应对高糖状态下大鼠脑缺血/再灌注损伤的保护作用

陈刚领，徐岚溪，赵　欢，吴晓莹，柴玲玲，曾冬琳，吴　琪

(中国药科大学中药学院1.中药药理教研室、2.生药学研究室，江苏南京　211198)



肢体后适应对高糖状态下大鼠脑缺血/再灌注损伤的保护作用

陈刚领1，徐岚溪1，赵欢1，吴晓莹1，柴玲玲1，曾冬琳1，吴琪2

(中国药科大学中药学院1.中药药理教研室、2.生药学研究室，江苏南京211198)

摘要:目的探讨肢体后适应(limb remote ischemic postconditioning，LRIP)对急性高糖状态下大鼠脑缺血/再灌注损伤(ischemia-reperfusion injury，IRI)的保护作用，并初步阐明其机制。方法大鼠腹腔注射50%葡萄糖(6 mL·kg(－1))造成急性高血糖模型，采用线栓法复制大脑中动脉栓塞(middle cerebral artery occlusion，MCAO)模型，将大脑中动脉栓塞1.5 h后再灌注，且同时刻给LRIP组大鼠LRIP操作，将大鼠左后肢股动脉夹闭5 min/再通5 min(此为1个循环)，连续3个循环。再灌注2 h后，检测各组大鼠行为学指标，摘眼球取血，测定血清中一氧化氮(nitric oxide，NO)浓度及超氧化物歧化酶(superoxide dismutase，SOD)活力;取全脑切片后氯化三苯基四氮唑(2，3，5-triphenyhetrazolium chloride，TTC)染色检测脑梗死面积。结果LRIP能改善急性高血糖状态下脑IRI大鼠的行为学评分，升高血清中NO浓度及SOD活力，能减小脑梗死面积，以上指标LRIP组与IRI模型组比较差异均具有显著性(P＜0.05)。结论LRIP对急性高血糖状态大鼠的脑IRI有保护作用，该作用部分通过升高血清SOD活力及NO水平实现。关键词:肢体后适应;急性高血糖;缺血/再灌注;超氧化物歧化酶;一氧化氮;大鼠

在所有脑卒中病例中，缺血性脑卒中占87%。尽管多年来人们不断努力寻求脑卒中的防治方法，但其发病率高、死亡率高、致残率高、复发率高的特点仍未能根本改变［1－4］。对急性缺血性脑卒中的治疗，特别强调超早期(发病1～6 h内)、急性期(发病48 h内)的溶栓，降纤(降解纤维蛋白原)，脑血管搭桥及介入疗法治疗［5］。但是，血流再通后造成的脑缺血/再灌注损伤(ischemia-reperfusion injury，IRI)又给缺血性脑卒中的治疗带来新的问题。

高血糖是影响发病的重要因素，研究表明，高血糖患者患缺血性脑卒中的危险程度是血糖正常者的2.40倍，且患病危险性男性高于女性［6］。此外，在高血糖状态下，脑梗死区域血流再通后造成的IRI会更严重［7－9］。

肢体后适应(limb remote ischemic postconditioning，LRIP)是在机体重要器官(如心、脑)缺血后的再灌注时段，对远端肢体做短时间的缺血/再通血的操作，以减轻重要器官IRI的一种疗法。大量研究表明，LRIP能有效减轻脑IRI［10－14］。但LRIP能否减轻高血糖状态下的脑IRI尚未知，我们的本项研究运用大鼠急性高血糖模型，验证LRIP对高血糖状态下脑IRI的作用，并初步探讨其机制。

1　材料与方法

1.1材料①药品与试剂:葡萄糖测定试剂盒、SOD测定试剂盒、一氧化氮(NO)测定试剂盒，均由南京建成生物工程研究所提供;氯化三苯基四氮唑(2，3，5-triphenyhetrazolium chloride，TTC)，美国Sigma公司产品;50%葡萄糖注射液，购自湖南科伦制药有限公司。②动物: SD大鼠，♂，体质量(260 ±20) g，清洁级，购于江苏大学，许可证号: SCXK(苏) 2013－0011。③主要仪器设备:酶标仪(荧光酶标仪Varioskan Flash，Thermo Electron Corporation)。

1.2方法

1.2.1分组将30只SD大鼠随机分为3组(n=10) :高血糖假手术组(Sham组)、高血糖+缺血/再灌注损伤模型组(IRI组)、高血糖+缺血/再灌注损伤+肢体后适应组(LRIP组)。所有大鼠腹腔注射50%葡萄糖(6 mL·kg－1)，造成急性高血糖［15－16］。将各组大鼠于注射葡萄糖30 min后麻醉，除Sham组外，分离其他两组大鼠右侧颈总动脉，从颈外动脉向颈内动脉插栓线，栓塞大脑远端中动脉(MCAO)。对于Sham组大鼠，仅分离右侧颈总动脉、颈外动脉及颈内动脉而不插线。待大脑远端中动脉栓塞1.5 h后，拔出栓线至颈外、颈内动脉的分叉处，使再灌注。其中，LRIP组于再灌注的同时立刻做LRIP操作，即夹闭大鼠左后肢股动脉5 min/再通5 min(此为1个循环)，连续3个循环。各组大鼠于再灌注2 h后(Sham组大鼠同时刻处理)作行为学测定。

1.2.2本位反射测定将大鼠放置于桌面上，操作者一手提大鼠尾巴，另一只手轻推大鼠的肩部，将其横向移动20 cm，之后向相反的方向重复该测试。正常大鼠反应为左上肢支撑或抓桌面，IRI组大鼠表现为左上肢力度减弱或无反应。评分0～2分，得分越多，功能损害越严重。0分，大鼠抵抗力较大，并且在推动过程中不断用上肢支撑或抓桌面; 1分，左上肢对抗力度减小; 2分，左上肢无对抗，既不支撑也不抓桌面［17］。

1.2.3前肢放置测定该测定用大鼠触须诱导的前肢放置情况来评价。操作者手持大鼠躯体，使大鼠的前肢能自由运动，轻轻的上下晃动大鼠，使大鼠肌肉充分放松。操作者将大鼠放置在桌边，使大鼠的胡须触到桌面的边缘，正常的大鼠会将两侧的前肢迅速放到桌面上。单侧大脑损伤的大鼠，损伤大脑同侧的前肢仍保持较好的反应能力。每只大鼠测定10次，记录前肢放置失败的次数［18］。

1.2.4尾部悬空测定操作者提大鼠尾部，使大鼠头部距桌面5～10 cm，一侧大脑损伤的大鼠会将身体迅速转向另一侧。记录大鼠扭转身体角度超过90°的次数，重复20次，记录有效抬头的百分率［17］。

1.2.5血清中NO浓度测定将测定过本位反射后的各组大鼠摘眼球取血，离心分离血清，用试剂盒测定血清中NO浓度。

1.2.6血清中SOD活力测定将测定过本位反射后的各组大鼠摘眼球取血，离心分离血清，用试剂盒测定血清中SOD活力。

1.2.7脑梗死面积测定将各组大鼠取全脑，－20℃冷冻15 min后连续切出5片冠状切片，每片厚度约为2 mm，置于1% TTC溶液中，37℃避光孵育20 min，每5 min翻动一次，之后用PBS溶液清洗3次，4%甲醛溶液固定24 h后拍照，用图像分析软件计算梗死面积。脑梗死面积/%=(非缺血半球的面积－缺血半球未梗死部分的面积)/非缺血半球的面积×100%。以梗死面积百分比反映缺血后脑损伤的严重程度，统计结果进行组间比较［14，19］。

2　结果

2.1血糖值测定高血糖组大鼠在手术前30 min腹腔注射50%葡萄糖6 mL·kg－1，造成急性高血糖。在注射葡萄糖前(0 h)，以及注射葡萄糖后0.5、1.5、3、4 h尾尖取血，离心分离血清。测定血糖值，结果表明，急性高血糖模型造模成功(Fig 1)。

Fig 1　Blood glucose values ofacute hyperglycemia rat (±s，n=6～8)

2.2行为学评分测定

2.2.1本位反射测定实验结果显示，与Sham组大鼠相比，Control组(IRI组)大鼠前肢抵抗能力减弱，前肢支撑及抓桌面力度均降低甚至消失。LRIP对急性高血糖状态下脑IRI大鼠本位反射无改善作用(Fig 2)。

2.2.2前肢放置测定与Sham组相比，Control组大鼠胡须触碰到桌面后，左前肢抓桌面的次数明显减少。LRIP操作对脑IRI大鼠的前肢放置无改善作用(Fig 3)。

Fig 2　Postural reflex test (±s，n=6～8)

Fig 3 Vibrissa test±s，n=6～8)

2.2.3尾部悬空测定Control组与Sham组相比，大鼠向左侧弯曲身体的次数明显增多(P＜0.01)。LRIP操作能明显减少脑IRI大鼠左侧弯曲身体的次数(P＜0.05，见Fig 4)。

2.3脑梗死面积测定与Sham组相比，Control组大鼠的脑梗死面积增大，差异具有显著性(P＜0.01)。LRIP能减小脑IRI大鼠的脑梗死面积(见Fig 5)。

2.4血清中的SOD活力LRIP能升高脑IRI模型大鼠血清中的SOD活力，与Control组相比差异具有显著性(P＜0.05)。见Fig 6。

Fig 4　Tail hang test (珋±s，n=6～8)

Fig 5 Representative infarcts stained by TTCfrom each group (±s)

2.5血清中的NO浓度Control组大鼠血清中NO浓度增高，与Sham组相比差异具有显著性(P＜0.01)。经过LRIP操作后，大鼠血清中NO浓度升高，与Control组相比差异具有显著性(P＜0.01)。见Fig 7。

Fig 6 SOD activity in rat serum (±s，n=6～8)

Fig 7 NO concentration in rat serum(±s，n=6～8)

3　讨论

高血糖是影响缺血性脑卒中发病的重要因素，在高血糖状态下，机体患缺血性脑卒中危险程度增加，且后继的IRI亦会加重［7］。高血糖加重脑IRI可能与兴奋性氨基酸中毒、自由基生成、钙超载、血脑屏障破坏、炎性因子的损害以及细胞凋亡等因素相关［20－22］。

我们之前的研究表明，LRIP能有效减轻脑IRI［14］，但LRIP是否能减轻高糖状态下的脑IRI尚属未知。本研究结果表明，LRIP能改善急性高血糖状态下脑IRI大鼠的尾部悬空测定评分，减小模型大鼠的脑梗死面积，升高IRI模型大鼠血清中的NO浓度及SOD活力。

在高血糖状态下，LRIP升高血清中SOD活力可增加自由基清除，减少后者造成的损伤［23－24］。NO浓度升高可以扩张血管，改善IRI造成的“无复流现象”［25－26］。但过高浓度的NO也可能会导致渗出增多，水肿加重，具体有待进一步研究证实。

综上，本研究结果表明，LRIP能减轻高血糖状态下大鼠的脑IRI损伤，该作用部分通过升高血清SOD活力，增加自由基清除，以及提升血清中NO浓度以增加侧枝循环实现。我们进一步的研究将关注LRIP减轻高血糖状态下脑IRI的具体机制。

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Protective effects of limb remote ischemic postconditionting on ischemic stroke rats under hyperglycemia

CHEN Gang-ling1，XU Lan-xi1，ZHAO Huan1，WU Xiao-ying1，CHAI Ling-ling1，ZENG Dong-lin1，WU Qi2
(1.Dept of Pharmacology of Chinese Materia Medica，China Pharmaceutical University，Nanjing 211198，China; 2.Dept of Pharmacognosy Research，China Pharmaceutical University，Nanjing 211198，China)

Abstract:AimTo study the protective effects of limb remote ischemic postconditioning (LRIP) on ischemic stroke rats under hyperglycemia and explore the mechanisms.Methods Rats were given 50% glucose (6 mL·kg(－1)) by intraperitoneal injection to get acute hyperglycemia model.Then middle cerebral artery occlusion (MCAO) models were created.After blocking middle artery for 1.5 h and reperfusion for 2 h，behavioral testing，infarct size of brain，NO concentration and SOD activity in the serum of those rats were detected.ResultsLRIP could improve behavioral score，decrease the area of cerebral infarction，increase the concentration of NO and the SOD activity in serum of MCAO rats.ConclusionLRIP can relieve cerebral ischemia-reperfusion injury of MCAO rats under acute hyperglycemia.

Key words:limb remote ischemia-postconditioning; acute hyperglycemia; ischemia-reperfusion injury; SOD; NO; rat

作者简介:陈刚领(1980－)，男，博士，讲师，研究方向:心脑血管药理学，Tel: 025-86185127，E-mail: chengangling@ cpu.edu.cn

基金项目:国家自然科学基金资助项目(No 81473317) ;中国药科大学中央高校基本科研业务费专项资金(No 2015PY016) ;江苏高校优势学科建设工程资助项目(PAPD) ;大学生创新药物研制能力提高项目(No J1030830) ;江苏省级大学生创?新创业训练计划项目

收稿日期:2015－01－30，修回日期:2015－03－05

文献标志码:A

文章编号:1001－1978(2015) 06－0780－05中国图书分类号: R-332; R322.81; R323.7; R587.1; R743.31; R977.3

doi:10.3969/j.issn.1001－1978.2015.06.009