试验性鸭大肠杆菌病的病理学动态观察

黄愉森 (深圳市龙岗区仁民动物医院 广东深圳518100)

鸭大肠杆菌病（Colibacillosis）是由某些致病血清型或条件致病性大肠埃希氏杆菌引起鸭的一种急性或慢性传染病。该病以秋末春初多发，发病急，死亡快，主要侵害2～6周龄的雏鸭。易感染禽群可经污染的饲料饮水，通过消化道感染，此外呼吸道、种蛋等也具有很重要的传播作用。新出壳的雏鸭发病后，体质软弱，合眼缩颈，腹围较大，常有腹泻，多因败血症死亡。较大的雏鸭发病后，精神萎靡，食欲减退，隅立一旁，缩颈嗜眠，两眼和鼻孔处常附黏性分泌物，有的病鸭排灰白色或绿色稀便，呼吸困难，常因败血症或体质衰竭，脱水死亡。不管是原发性或继发性，其主要特征为发生心包炎、肝周炎、气囊炎和输卵管炎的病变。雏鸭的大肠杆菌剖检主要变化可见有心包膜、心内膜、肝被膜和气囊膜表面有黄白色纤维性渗出物，有的腹膜可见到渗出性炎症，肝脏多肿大，脾脏肿大发黑，剖开腹腔有腐败气味，有的雏鸭有脐炎病变。眼炎型的多见于1～2周龄的雏鸭；关节炎型的多见于7～10日龄的雏鸭；脑炎型多见于1周龄雏鸭；浆膜型的多见于2～6周龄雏鸭[1]。在临床上可以单独发生或者与其他疾病混杂在一起，造成较复杂的局面，对养禽业造成了较大的损失[2，3，4]。国内在1982年由郭予强[5]最先报道广东省2个大型鸭场的2～6周龄的雏鸭发生大肠杆菌败血症；李冰[6]2001年报道黑龙江省肇州县某鸭场饲养的1 500只5日龄雏鸭陆续发病，发病率达34.2%，死亡率达20%；2005年，江苏省宝应县某养鸭场雏鸭暴发大肠杆菌病，发病率40%，死亡率为21%[7]。可见，随着养鸭业的不断发展，大肠杆菌病已成为影响养鸭生产效益的重要疾病之一。

综合国内外研究情况，目前对于该病的病原生物学特性、病型、临床症状和剖检变化等方面进行了较多的研究，而对本病的病理学动态变化进行全面系统的观察国内尚较少见报道。鉴于全面系统地研究白鸭大肠杆菌的病理学动态变化，以探讨该病菌感染鸭的发病机理，可为有效防治该病提供理论依据，故本试验对白鸭感染大肠杆菌后各时间段的全身器官组织的病理学变化进行了较为详细的探讨。

1 材料与方法

1.1 试验材料

1.1.1 菌株

鸭源大肠杆菌O28株，由佛山科学技术学院畜牧兽医研究所提供。

1.1.2 试验动物

1日龄仙湖肉鸭，购自佛山科学技术学院科研禽场。

1.1.3 培养基

麦康凯琼脂培养基和普通琼脂培养基,均按常规方法配制。

1.1.4 主要试剂

10%福尔马林溶液、各种浓度酒精、二甲苯、石蜡、苏木素伊红染色液、中性树胶等。

1.2 试验方法

1.2.1 试验动物分组与接种

将100只15日龄健康雏鸭随机分为2组：试验组70只，经肌肉注射大肠杆菌O28株24h液体培养物，0.5mL/只。对照组30只，经肌肉注射灭菌营养肉汤，0.5mL/只。试验组和对照组在外界条件相同的情况下，隔离饲养。

1.2.2 临床观察与试验组织材料的采取

在试验鸭接菌后32h、40h、48h、56h和64h的各时间点分别观察试验雏鸭1次，记录出现的临床症状，对死亡和濒临死亡的雏鸭进行剖检，观察病理变化。并在上述各时间段随机从试验组及对照组各取2只，扑杀后采取心、肝、脾、肺、肾、胰、脑、胸腺、盲肠扁桃体、法氏囊和哈德氏腺等器官组织，用10%福尔马林溶液固定，制成石蜡切片，采用HE染色方法，光学显微镜观察各器官的病理动态学变化。

1.2.3 感染鸭细菌的分离与鉴定

无菌操作采取感染雏鸭心血、肝和脑组织进行细菌分离培养和生化鉴定。

1.2.4 组织切片的制备

1.2.4.1 固定将上述所采取的新鲜组织块放入10%福尔马林固定液中，固定12～36h。

1.2.4.2 脱水、透明

脱水之前进行水洗，充分水洗除去固定液，以免影响染色，经固定的组织内因多量的水分较柔软，不易切成薄片，须让石蜡透入组织，因蜡冷凝后即成硬块，便于薄切，但石蜡不能与水相混。因此，在浸蜡包埋前须将其中水分完全除去。

常用的脱水剂是酒精，因酒精有脆化组织使组织强度收缩的作用，为减少组织收缩，应先从低浓度开始，然后递增浓度，直至无水酒精。水洗后的组织，经修整成组织块装入脱水盒里并放入70%酒精中进行脱水，然后将组织块移入85%酒精—98%酒精（Ⅰ）、（Ⅱ）—100%酒精（Ⅰ）、（Ⅱ），在各级浓度酒精中各置2h。

1.2.4.3 浸蜡与包埋

浸蜡即将已透明的材料移入熔化的石蜡内，其目的是去除组织中的透明剂，而使石蜡渗入组织中。先将透明的组织块移入二甲苯与石蜡各半的混合液中，在60℃恒温箱中放置10～15min，然后移入熔化的石蜡（Ⅰ）、（Ⅱ）每级各置1～2h，置于恒温箱中。然后将包埋用的金属包埋框置于平台上，倒入已熔化的石蜡，随即从石蜡（Ⅱ）中取出组织块，切面朝下，放于框的正中，贴上标签，待石蜡凝结后，拆去包埋框，即成石蜡块。

1.2.4.4 切片

切片前，先将蜡块修整成正方形或长方形，然后将蜡块贴在一小木块上，贴上标签后，将蜡块装在切片机上，切成5～7μm的薄片，切下的薄片连成蜡带，用毛笔轻轻取下蜡带，装在盒内。

1.2.4.5 展片与粘片

将切下的组织薄片放入摊片机内，将其浮在水面上自然展开，水温保持40℃左右，用镊子将完整的组织片分离开来，然后将经酒精浸泡的盖玻片用镊子夹起，捞出组织片，倾去水分，将其放于切片盒上，放入37℃左右恒温箱经12h烤干。

1.2.4.6 HE染色与固定

组织材料切成薄片后，多为无色，必须经各种染色，方可在显微镜下鉴别各种组织的微细结构。含有石蜡的组织片不能被水溶性染料染色。因此，染色前必须先用二甲苯将石蜡脱掉，然后经95%、85%和70%各级酒精，使组织逐步接近于水，最后用蒸馏水洗去酒精，即可染色。（1）脱蜡：首先将切片放入二甲苯（Ⅰ）—二甲苯（Ⅱ）中，各置5min，以溶去切片的石蜡。然后将脱蜡的切片经各级浓度酒精逐渐下行至水，即将切片从二甲苯（Ⅱ）中取出移入95%酒精—80%酒精—70%酒精—50%酒精，各级中停留2min，最后放入蒸馏水中。（2）染色：细胞核染色：将切片从水中移入HANSEN苏木素染液中染8min，待胞核呈紫蓝色。用水洗去切片上残余的染液5min，然后用盐酸酒精分色数秒钟。再将切片放入蒸馏水中15～20min，加以蓝化。细胞质染色：用0.5%伊红染液1～2min至胞质呈粉红色。

1.2.4.7 脱水

依次放入80%酒精—95%酒精（Ⅰ）、（Ⅱ）—100%酒精（Ⅰ）、（Ⅱ）各置2min，以去除切片上的水分。

1.2.4.8 透明

切片放入二甲苯（Ⅰ）、（Ⅱ）各置5min。

1.2.4.9 封片

将浸润在酒精中的载玻片取出，用净纱布擦干净，贴上标签，然后在载玻片中适当位置滴1滴中性胶干燥。

1.2.5 切片观察

使用光学显微镜观察各切片的细微病理组织结构，并根据不同时间段做好记录，备用。

2 试验结果

2.1 临床症状和大体病理变化

细菌接种后32h，可见部分鸭只开始出现精神沉郁（图1），食欲减退。接种后40～48h，试验鸭下痢，出现呼吸困难。死亡鸭剖检病理表现为：①心包积液、混浊，心包膜表面被覆淡黄色的纤维素性渗出物，心包不透明。②腹腔有渗出液,淡黄色。③肝脏：肿大,实质较脆，呈土黄色或红褐色，表面覆盖有一层灰白色或灰黄色纤维素性膜状物，容易剥离；胆囊肿大，胆汁黏稠，呈黄褐色。④气囊：气囊混浊增厚，表面覆盖有灰白色或灰黄色纤维素性渗出物。⑤肠道：肠壁变薄,里面有大量液体，剪开肠壁流出的是黄绿色液体；肠道呈卡他性或坏死性炎症。⑥脑:部分病死鸭脑膜出血、充血。接种后56～64h，试验鸭可见不同程度的气囊炎、肝周炎和心包炎等病变（图2）。

2.2 感染细菌分离结果

从试验感染雏鸭心血、肝和脑组织均分离到细菌，经培养、生化鉴定，其特性与接种菌株相同。

2.3 组织病理学动态变化

2.3.1 心

32h：心外膜增厚，其间有大量纤维素性渗出；心肌纤维变性，心肌纤维间可见多量红细胞（图3）。

40h：心肌纤维变性，结构比较紊乱，心肌纤维间出血。

48h：心肌纤维出现变性、萎缩，纤维间出血，血管扩张，充满大量红细胞和少量大肠杆菌（图4）。

56h：心肌纤维变性，心肌纤维间有多量红细胞。

64h：病变加深，心脏组织切片可见部分心肌细胞呈颗粒变性，在局部心肌细胞之间有炎性细胞浸润。

2.3.2 肝

32h：肝包膜增厚，有纤维素性渗出物；肝细胞变性，肝血窦扩张，并有多量红细胞，血管扩张，充满红细胞，血管周围可见少量炎症细胞（图5）。

40h：肝细胞变性、坏死。细胞索结构紊乱，在血管周围可见少量的炎症细胞（肝细胞崩解、碎裂）。

48h：肝细胞变性、坏死，肝细胞窦和中央周围堆积多量大肠杆菌、红细胞和少量的炎症细胞（血管扩张，充满红细胞）（图6）。

56h：病变比较严重，肝细胞变性，坏死，细胞崩解、消失，血管周围有少量炎症细胞，血管扩张，充满红细胞和炎症细胞（图7）。

64h：肝细胞变性、坏死，肝血窦扩张，并有多量红细胞。

2.3.3 肺

32h：肺泡壁增厚，毛细血管充血、出血，部分肺泡腔和细支气管也充满红细胞和粉红色的渗出物；（图8）。

40h：肺泡壁毛细血管充血、出血，在肺泡腔里可见大量红细胞聚集，在细支气管周围有多量炎症细胞浸润。

48h：细支气管内外及肺泡腔等整个肺组织内充满大量的炎性细胞和大肠杆菌；肺泡壁上充血、出血；肺泡结构模糊，细胞核浓缩，部分溶解，出现碎裂。

56～64h：肺间质明显增宽，有多量红细胞和炎症细胞，血管扩张，充满红细胞；部分肺泡壁上皮细胞变性、坏死，留下淡染的细胞支架；部分肺泡腔充满丝网状的纤维素性渗出物（图9，10，11）。

2.3.4 肾

32h：肾小管上皮细胞肿胀、脱落，肾间质出血；部分肾小球萎缩（图12）。

40h：肾间质出血比较严重，肾小管上皮细胞崩解、脱落，肾小球萎缩。

48h：肾小管上皮细胞变性、坏死，肾间质出血，并有多量菌体（图13）。

56～64h：肾小管上皮细胞与基底层脱离，肾小管上皮细胞核浓缩，部分上皮细胞崩解、脱落，肾小管结构模糊，肾间质出血。

2.3.5 脾

32～40h：红髓堆积多量红细胞，白髓淋巴细胞变性、坏死，数量减少，形成坏死灶。

48h：病变比较严重，脾的红髓和白髓淋巴细胞都出现变性、坏死和数量减少，形成大范围的坏死灶，并可见多量菌体出现（图14）。

56～64h：病变比较轻，红髓堆积多量红细胞，白髓淋巴细胞变性、坏死，形成局灶性坏死灶（图15）。

2.3.6 脑

32h：脑血管及毛细血管间质增宽，神经元细胞结节状，弥漫性增生，部分神经元细胞浓缩、变性和坏死（图16）。

40h：脑组织结构比较疏松，可见少量大肠杆菌和红细胞，血管周围间隙明显增宽。

48h：病变比较严重，神经胶质细胞呈弥散性或局灶性增生，血管周围间隙明显增宽，在实质里可见大肠杆菌，部分神经元变性，核浓缩（图17）。

56～64h：病变比较轻，血管周围间隙增宽，部分神经元细胞变性。

2.3.7 胰

32～40h：腺泡间质有少量红细胞，腺泡上皮细胞变性、坏死，形成坏死灶（图18）。

48h：腺上皮细胞严重变性、坏死，形成多个坏死灶，腺泡间质有多量炎性细胞浸润，并有少量红细胞和大肠杆菌（图19）。

56～64h：腺泡上皮细胞变性、坏死，形成局灶性坏死，核浓染，腺泡间质出血（图20，21）。

2.3.8 法氏囊

32～40h：未见明显病理变化。48～56～64h：淋巴细胞结构的髓质和皮质的淋巴细胞减少（图22，23）。

2.3.9 十二指肠

32～40h：小肠绒毛上皮细胞崩解、脱落。

48～56～64h：小肠绒毛上皮细胞崩解、脱落，固有层有多量的炎性细胞浸润。

2.3.10 胸腺

32～40h：未见明显病理变化。

48～64h：胸腺髓质区明显增宽、出血、皮质变薄

（图24）。

附图

图1患鸭精神沉郁

图2 患鸭形成纤维素性心包炎、肝周炎和腹膜炎

图3 心32h：有少量红细胞浸润，心肌间质增宽（水肿），心肌纤维断裂、坏死（HE 400×）

图4 心48h：心肌颗粒变性、断裂和排列紊乱，心肌纤维间出血，并有少量菌体（HE 400×）

图5 肝32h：肝细胞脂肪变性，血管周围有炎性细胞浸润（HE 400×）

图6 肝48h：大量的大肠杆菌侵入肝索和肝血窦内（HE 400×）

图7肝56h：肝细胞结构模糊，肝索结构紊乱、断裂和溶解；肝细胞浓缩，出现肝细胞核碎裂（HE 400×）

图8 肺32h：肺泡壁毛细血管充血、出血，部分肺泡腔充满炎性渗出物和红细胞（HE400×）

图9 肺48h：肺泡上皮细胞变性、坏死，肺泡腔内有多量菌体（HE 400×）

图11 肺56h：广泛性出血，肺泡结构模糊，细胞核浓缩，部分溶解，出现核碎裂（HE 400×）

图10 肺56h：肺泡壁毛细血管充血、出血（HE 400×）

图12 肾32h：淀粉样物质呈均质红染的块状或条索状，存在于窦状隙内皮和肝细胞索之间（HE 400×）

图13 肾48h：肾小管之间有大量红细胞浸润，肾小管上皮细胞与基底层脱离，肾小管上皮细胞核浓缩，部分上皮细胞崩解、脱落，肾小管结构模糊（HE 400×）

图14 脾32h：有大量的红细胞浸润，淋巴细胞数量减少，脾小体缩小，淋巴细胞变性、坏死（HE 400×）

图15 脾48h：脾的红髓和白髓淋巴细胞都出现变性、坏死和数量减少，形成大范围的坏死灶，并可见多量菌体（HE 400×）

图16 脑40h：脑血管及毛细血管间质增宽，可见少量红细胞（HE 400×）

图17 脑48h：神经元细胞结节状，弥漫性增生，部分神经元细胞浓缩、变性和坏死（HE 400×）

图18 胰40h：有多量的红细胞（HE 400×）

图19 胰48h：腺泡间质有少量红细胞浸润，有少量大肠杆菌浸入间质（HE 400×）

图20 胰56h：胰岛数量减少，部分腺泡出现变性、坏死（HE 400×）

图21 胰64h：淀粉样物质呈均质红染的块状或条索状，即腺泡淀粉样变（HE 400×）

图22 法氏囊48h：法氏囊滤泡的髓质内，淋巴细胞呈坏死、崩解，并出现大量异染性细胞、巨噬细胞和网状细胞（HE 400×）

图23 法氏囊56h：萎缩细胞内淋巴细胞多数消失，并为增生的网状细胞所替代（HE 400×）

图24 胸腺48h：胸腺髓质区明显增宽、出血，皮质变薄，出现坏死灶（HE 400×）

2.3.11 哈德氏腺

32～40～48～56～64h：部分腺泡上皮细胞崩解、脱落，黏膜下层细血管充血、出血，有纤维素渗出。

2.3.12 盲肠扁桃体

32～40h：未见明显病理变化。

48～56～64h：肠腺细胞、黏膜上皮细胞脱落、变性，少量出现坏死。

3 讨论

3.1 鸭大肠杆菌研究的目的及意义

近年来,鸭大肠杆菌病在许多地区广为流行,发病率和死亡率均较高。其危害性在某些地区甚至超过了常见的病毒性传染病,成为当前危害我国养鸭业较为严重的细菌性传染病之一。本试验主要观察各器官组织的病理动态学变化，探讨该病菌感染鸭的发病机理，为有效地防治该病提供理论依据与实践价值。

3.2 鸭大肠杆菌引起的临床症状和病理变化特点

试验选用目前在发病鸭群分离率较高的大肠杆菌O28对15日龄仙湖鸭进行人工致病，结果表明该菌株人工接种雏鸭具有强致病性，至接种后64h只有少数鸭存活。发病鸭形成明显的纤维素性心包炎、肝周炎和腹膜炎，复制出与自然病例一样的临床症状和病理变化的病鸭。细菌侵入鸭体后，在呈现急性败血症过程的同时，主要以侵害肺、肝和脑等为特征。人工肌肉接种感染潜伏期约为32h，感染鸭的临床症状主要表现为：细菌接种后32h，大部分鸭精神沉郁，食欲减退，部分鸭的肝、脾肿胀和瘀血；接种后40～48h，试验鸭下痢，出现呼吸困难；接种后56～64h，试验鸭可见不同程度的气囊炎、肝周炎和心包炎等病变。病理变化主要特征为：雏鸭在感染大肠杆菌后32～64h，感染鸭的全身各器官组织的细胞均出现不同程度的变性、坏死和数量减少，有纤维素渗出，并在感染后48h可见病鸭的心、肝、肺和胰等有菌体聚集等病理特征。该病变特征与典型鸭大肠杆菌病一致[8]。

3.3 鸭大肠杆菌对机体各器官组织的损伤

试验结果显示，人工接种致病性大肠杆菌后主要损伤试验鸭的心、肝、脾、肺、肾、胰和脑等器官组织，在攻毒后32h可见不同程度的损伤，至48h各器官组织损伤明显，主要表现为组织细胞变性、坏死，细胞间质出血和炎症细胞浸润等组织病理学变化，并在组织中观察到菌体。至攻毒后56～64h各器官组织病变逐渐减轻。另外，试验鸭的法氏囊、胸腺和盲肠扁桃体等免疫器官组织损伤较轻，至攻毒后48h才出现较轻度的炎症。

3.4 鸭大肠杆菌引起的各组织器官的病理损害对整个机体功能的影响

机体生命活动的维持有赖于机体内环境的动态平衡的相对稳定。体液中氧和二氧化碳的浓度与营养物质及代谢产物的浓度、温度等都必须维持相对的稳定，而机体的各种活动都在维持这种相对的稳定。若内环境稳态的变动超过一定限度，则必然对机体造成危害[9]，严重的甚至会造成机体的死亡。内环境稳态的维持决定于消化、呼吸、循环和排泄等系统的功能活动，但血液所引起的作用也是较重要的。总之，身体的各部分，以致构成身体的每一个细胞都以它自己的方式参与维护体内环境的稳定[10]。而大肠杆菌侵害机体后引起各组织器官病变而导致各器官功能障碍，从而使机体的内环境失平衡，最终造成机体的死亡。

4 结论

（1）试验菌株人工接种雏鸭具强致病性，潜伏期约为32h，发病死亡高峰集中在48～56h，患鸭出现特征的纤维素性心包炎、肝周炎和腹膜炎。

（2）试验鸭攻毒后32h可见对心、肝、脾、肺、肾、胰和脑等器官组织的损伤，至48h损伤明显，至56h后逐渐减轻。主要表现为组织细胞变性、坏死，细胞间质出血、纤维素性渗出和炎症细胞浸润等组织病理学变化。对免疫器官组织损伤较轻，攻毒后48h出现轻度炎症。

[1]SaifYM ,BearnesHJ,Glisson,JR,etal.Diseasesof poultry[J].Ames：IowaStateUniversityPress,2003（11）,354-363.

[2]韩云,李兰春.雏鸭曲霉菌与大肠杆菌混合感染的诊治[J].中国兽医杂志,2002,38（1）:57.

[3]乐涛,陈凤,曾徐健,等.鸭疫里默氏杆菌和大肠杆菌合并感染的诊断[J].中国家禽,2006,28（1）:20-22.

[4]房宝志,李尚泉,孙明,等.鸭病毒性肝炎并发大肠杆菌病的诊治[J].畜牧兽医杂志,2003,22（6）:31.

[5]刘萍,胡世君,周秀富,等.雏鸭大肠杆菌病病原的分离及药敏试验[J].畜禽业,2005,（10）:36-40.

[6]李冰,宜立峰,魏秋梅.雏鸭大肠杆菌病的诊治[J].湖北畜牧兽医,2003,（1）:42.

[7]何宝恩,陈彬.雏鸭大肠杆菌病的诊治[J].甘肃畜牧兽医,2006,36（1）:32-33.

[8]辛朝安主编.禽病学（第二版）[M].北京:中国农业出版社,2003，162-166.

[9]张玉生,傅伟龙主编.动物生理学[M].北京：中国科学技术出版社,1994,37:427-431.

[10]陈守良编著.动物生理学（第二版）[M].北京：北京大学出版社,1996,109-110.