高效液相色谱法测定牛蒡子中牛蒡苷的含量

何 斌，张海静，杨文海，付书林，陈夏冰，邵志勇，刘 武，童伟文，陶弼菲，陈 洁★

（1. 武汉市畜牧兽医科学研究所， 430208；2. 华中农业大学动物医学院， 430070）

牛蒡子(Fructus Arctii)，始载于《名医别录》，原名恶实，别名鼠粘子、大力子、恶实，来源于菊科两年生草本植物牛蒡属牛蒡科(Arctium lappa L.)的干燥成熟果实，为常用中药。民间应用广泛，药理学证明有抗炎、抗菌、抗病毒、抗肿瘤、降血糖等作用。该中药活性成分为木脂素类化合物，主要是牛蒡苷(Arctiin)和牛蒡苷元(Arctigenin，ACT)等。牛蒡苷在中药牛蒡和毛头牛蒡果实中含量较高，具有很高的新药开发价值[1-3]。

牛蒡苷（Arctiin）是牛蒡子中的有效成分，具有抗病毒、抗菌、抗炎、抗肿瘤、降血糖等多种药理作用。具有疏散风热，宣肺透疹，利咽散结，解毒消肿之功效[4-6]。为更有效控制牛蒡子质量，采用高效液相色谱(HPLC)法测定牛蒡子中牛蒡子苷的含量，该法操作简便，结果准确，重复性好，可作为牛蒡子的质量控制方法。

1 材料与方法

1.1试验材料

美国Agi lent 1260型高效液相色谱仪，紫外检测器，Agilent ZORBAX SB-C18色谱柱(250 mm×4.6mm，5μm)；牛蒡苷对照品，中国药品生物制品检定所，含量98%，批号:110819-200404)；牛蒡子，购于武汉强康药业有限公司；甲醇、乙醇、乙腈为色谱纯，德国默克公司生产。

1.2试验方法

1.2.1色谱条件

色谱柱为Agi lent ZORBAX SB-C18(250 mm×4.6 mm，5 μm)；检测波长为280nm；流动相为甲醇-乙腈-水（31:20:49，V:V:V）；流速为1.0mL/min；进样量为30μL；柱温为(30±0.1)℃。

1.2.2样品处理

取3个不同批次的牛蒡子各5g，分别研细，各取取粉末0.5g，精密称定，置于50mL具塞锥形瓶中，精密加入甲醇40mL，密塞，超声处理30min，放冷，摇匀，用干滤器滤过，精密量取续滤液2mL，置25mL棕色量瓶中，加入甲醇稀释至刻度，摇匀，溶液经孔径0.22μm微孔滤膜滤过，滤液作为供试品溶液。

1.2.3标准曲线的建立

牛蒡苷标准储备液的制备，精确称取10mg牛蒡苷，溶于50mL棕色容量瓶中，甲醇定容，即得200μg/mL的标准储备液。然 后 依 次 配 制 成 浓 度 为0.0、0.5、1.0、10.0、50.0、100.0、200.0μg/mL的标准工作液，进样分析。分别以测得的峰面积(A)为横坐标，浓度(C)为纵坐标，建立标准曲线。

1.2.4方法学验证

取浓度分别为100.0、10.0、1.0μg/mL的牛蒡苷标准工作液，并进行HPLC检测，每个浓度1天内设置5个平行，以考察日内变异系数；重复检测5d，以测定日间变异系数，将100.0、10.0、1.0μg/mL的牛蒡苷标准工作液加入已知牛蒡苷含量的牛蒡子粉中，进行HPLC检测，测定回收率。

2 结果

2.1色谱行为

在本试验所建立的方法下，牛蒡子苷保留时间为14min左右，药物峰形对称性良好，基线平稳，药峰与杂质峰分离良好，无杂峰干扰。结果表明，本试验所建立的方法简便、快捷、稳定，检测效率高。空白色谱图（图1）、牛蒡苷元（1μg/mL）色谱（图2）。

图1 空白色谱图

表3 牛蒡子中牛蒡苷含量测定结果

图2牛蒡子苷（1μg /mL）色谱图

2.2标准工作曲线

牛蒡苷的标准工作曲线见图3。在本试验建立的方法下，牛蒡子苷标准品在0.5～200μg/mL范围内线性关系良好，相关系数r=0.9999，线性方程为y=0.0237x(x表示牛蒡苷的峰面积；y表示牛蒡苷的浓度)。

图3牛蒡苷的标准工作曲线

2.3方法学验证结果

取浓度分别为100.0、10.0、1.0μg/mL的牛蒡子苷标准工作液，并进行HPLC检测，测定结果为日内变异系数在5%以内；日间变异系数在10%以内；牛蒡子苷的回收率分别为89.69%～96.33%之间；表明检测方法准确稳定。具体回收率和变异系数见表1和表2。

表1日内和日间回收率考察结果(n=5)

表2日内和日间变异系数考察结果(n=5)

2.4样品的测定

取3个不同批次的牛蒡子样品(批号:140201，140615，040916)各5g。研细、粉碎、甲醇定容、超声、滤器、甲醇定容，溶液采用0.22μm微孔滤膜滤过，制成供试品溶液，分别精密吸取5μL，按上述色谱条件测定峰面积，计算牛蒡苷含量，每批样品测定5次，结果如表3。

3 讨论与小结

3.1提取溶剂的选择

根据牛蒡子苷的化学性质和相关报道[7-9]，分别以甲醇、乙醇和二氯甲烷作为牛蒡苷的提取溶剂，并对牛蒡苷提取量进行检测比较。结果表明甲醇和乙醇的提取效率基本相同，但高于二氯甲烷的提取效率；考察甲醇和乙醇的回收率发现，甲醇提取后牛蒡苷的回收率相对较高，故选择甲醇作为提取溶剂。

3.2流动相的选择及改进

根据药典相关文献报道，牛蒡苷的检测多采用甲醇-水（1:1.1）为流动相[10-11]，但在本实验检测过程中发现牛蒡苷出峰时间较短，不能与杂质分开，调节水相比例效果也不理想，且在试验过程中，甲醇-水混合的流动相易产生气泡，造成系统压力和基线不稳。因此改用乙腈-水为流动相，实验发现色谱峰分离不理想，与杂质不能良好分离。经过反复试验发现，采用甲醇-乙腈-水为流动相后，相比相关文献报道，试验所建立的方法中色谱峰与杂质峰得到良好分离，分离效果较好，出峰时间短，最终确定流动相为甲醇-乙腈-水（31:20:49，V:V:V）。通过本实验所建立的检测方法，测得牛蒡子中牛蒡苷的含量为4.31%，该法简便、准确、快速，可作为牛蒡子的质量控制方法。

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