杂种宠物犬的精液冷冻效果研究

王素梅，张淑娟，王艳辉，时广明，白彩霞，秦光彪，刘玉峰，陈晓华

(1.黑龙江职业学院，双城150111; 2.黑龙江省农业科学院 畜牧研究所，哈尔滨150086)

人工授精(AI) 是使用器械采集公畜的精液，再用器械把经过检查和处理后的精液输入到母畜生殖道内，以代替公母畜自然交配而繁殖后代的一种繁殖技术，被称为家畜繁殖领域的第一次革命。精液冷冻保存是人工授精技术的一项重大革新，它解决了精液长期保存的问题，使精液不受时间、地域和种畜生命的限制，它是推动AI 技术快速发展的重要动力。影响犬冷冻精液人工授精效果的因素众多［1］。本试验旨在通过杂种宠物犬精液冷冻过程中稀释操作和不同剂型间犬冻精冷冻效果的影响，以便为以后国内相关研究提供参考。

1 材料与方法

1.1 实验动物及器材

随机挑选6 只杂种宠物公犬分成A、B 两组。要求犬只健康、性欲强、性情温顺、无伤人史，年龄在2 ～8 岁。每日饲喂牡丹江新中旭狐貉全价配合饲料，每天定时、定量由固定饲养员饲喂，自由饮水。采精期间每天适当补充蛋白质，同时每只公犬每天补饲鸡蛋一枚。

试剂及仪器: 果糖、Tris(三羟基甲基甲烷) 、柠檬酸钠、卵黄、甘油、青霉素、链霉素。犬用集精杯、温度计、漏斗、天平、消毒锅、细管、光学显微镜等。

1.2 实验方法

1.2.1 精液采集

采用手握法进行采精。采精前对公犬进行调教1 周，使其熟悉采精环境，安排在每天早、晚进行，使公犬形成稳定的条件反射。采精时，在同一时间、同一地点，均采用手握法进行采精。每天每只犬采集1 次精液，然后分为两份。

1.2.2 精液处理

采精后，立即对精液进行常规检查，包括精液颜色、气味、精液量、精子活力、密度、畸形率、顶体完整率等项目。精子活力采用十级评分制，其余操作正常进行。检查后，按设计要求进行稀释、分装和保存处理。

1.2.3 精液稀释液配方确定及试验设计

根据国内外进行犬精液冷冻研究中应用最广泛的稀释液配方，以冻精的解冻后精子活力作为评定标准，经预备实验及禹学礼等实验结果并结合自己的一些改进，确定犬精液冷冻稀释液为Tris-果糖稀释液。配方分为两部分，分别是I 液和II 液。其中I 液包括Tris 3.025g，果糖1.7 g，柠檬酸钠1.36 g，甘油3 mL，双蒸水100 mL; II 液包括Ⅰ液76 mL，卵黄20 mL，甘油5 mL，青霉素1 000 IU/mL，链霉素1 000 μg/mL。

本试验中对采集的新鲜精液进行品质检查后，分别用事先配制好的Tris-果糖稀释液采用一步稀释法和两步稀释法均按照1∶2 倍进行稀释。两种稀释方法均采用降温2 h 至4℃，再平衡2 h 的方法进行。一步稀释法和两步稀释法的细管精液均在平衡后通过自制恒温设施下进行分装，然后通过熏蒸法进行颗粒冻精以及细管冻精的冻结。样品冻结面距离液氮面高度为1.0 cm，停留5 min，然后待精液冻结后，迅速将精液移入液氮中。

本实验以杂种宠物犬精液的精子活力作为评定指标，用两种精液稀释法冷冻犬精液，分别比较三种冷冻方式下精液冷冻前后精子活力的优劣，以探索常规方式下宠物犬精液冷冻程序。

2 结果与分析

2.1 同一稀释法不同剂型冷冻效果比较

经SPSS 检验，采用一步稀释法的颗粒冻精的解冻后活力(0.37 ±0.01) 与0.25 mL 细管冻精的解冻后活力(0.35 ±0.01) 和0.5 mL 细管冻精的解冻后活力(0.32 ±0.01) 的差异均显著(P ＜0.05) ，而0.25 mL 细管冻精的解冻后活力(0.35 ±0.01)与0.5 mL 细管冻精的解冻后活力(0.32 ±0.01) 的差异极显著(P ＜0.01) ，这与禹学礼等［1］试验结果基本一致; 采用两步稀释法的颗粒冻精的解冻后活力(0.40 ±0.01) 与0.25 mL 细管冻精的解冻后活力(0.39 ±0.01) 以及0.5 mL 细管冻精的解冻后精子活力(0.36 ±0.02) 的差异均不显著(P ＞0.05)(见表1) 。

表1 同一稀释法不同剂型解冻后精子活力效果比较

2.2 不同稀释方法精液冷冻效果比较

经SPSS 检验，颗粒冻精采用一步稀释法的解冻后精子活力(0.37 ±0.01) 与采用两步稀释法的解冻后精子活力(0.40 ±0.01) 差异不显著(P ＞0.05) ; 0.25 mL 细管冻精采用一步稀释法的解冻后精子活力(0.35 ±0.01) 与采用两步稀释法的解冻后精子活力(0.39 ±0.01) 差异显著(P ＜0.05) ;0.5 mL 细管冻精采用一步稀释法的解冻后精子活力(0.32 ±0.01) 与采用两步稀释法的解冻后精子活力(0.36 ± 0.02) 差异不显著(P ＞0.05) (见表2) 。

表2 不同稀释方法冷冻精液剂型解冻后精子活力比较

3 结论与讨论

本试验结果表明，杂种宠物犬精液冷冻保存时采用一步稀释法颗粒冻精的冷冻效果比0.25 mL 细管和0.5 mL 细管均好，而两步稀释法对不同冻精剂型的影响不明显。

因此，可以考虑以后对犬精液进行冷冻均采用两步稀释法，这与Pena A.等的研究发现先用含低浓度甘油(3%) 稀释液稀释精子，再用含高浓度甘油(7%) 稀释液等倍稀释后的精液在解冻后质量更佳的研究结果相一致［2］。

［1］禹学礼，庞有志.犬精液冷冻与人工授精的进展［J］.洛阳农业高等专科学校学报，1999，6.

［2］Pena A，Linde-Forsberg C.Effects of Equex，one or two stip dilution，and two freezing and trawing rates on post- thaw survival of dog spermatoa ［J］.Theriogenology，2000，54: 859 ～875.