李小杰,王海涛,李淑君,陈玉国,李成军,李彦平
(河南省农业科学院烟草研究所,河南 许昌 461000)
豫南烟区烟草青枯病危害调查及病原鉴定
李小杰,王海涛*,李淑君,陈玉国,李成军,李彦平
(河南省农业科学院烟草研究所,河南 许昌 461000)
摘要:2014年从豫南烟区信阳市罗山县、驻马店市确山县和遂平县共采集25个疑似青枯病烟草病样和10份病土,分离纯化出菌株26个,测序所得的序列与NCBI数据库中的Ralstonia solanacearum基因组序列进行Blast比对,相似度达到98%以上,对分离鉴定得到的烟草青枯病菌进行回接试验,表现出典型的青枯病症状,发病组织在TTC培养基上也同样分离得到典型的青枯菌菌落,证实病原为烟草青枯病病原。由此表明,豫南烟区确有烟草青枯病的发生。
关键词:烟草青枯病;病原菌分离;鉴定
烟草青枯病是威胁世界烟草生产的一大毁灭性病害[1],属于典型的高温高湿型病害,同时也是严重危害烟草根茎部的主要细菌性病害。目前在我国长江流域及其以南烟区普遍发生,其中以福建、湖南、四川、贵州及广西为害严重[2-3]。我国南方烟草青枯病个别年份爆发流行,造成毁灭性损失。近年来,由于气候等方面的原因造成该病有向北扩展蔓延的趋势[4],同处黄淮烟区的山东也有发生[5],安徽亳州发病较重,青枯病的病原菌有向低温型变异的趋势。
近年来,豫南烟区局部地块烟草茎下部黑色坏死病株危害上升速度很快,发病率可达80%左右,严重时造成全田烟草枯死。本课题组曾于2011—2013年在驻马店、信阳烟区发现零星疑似青枯病病株,并进行了病原分离,但回接时未造成烟株发病,因此豫南烟区是否确有烟草青枯病一直存在争议。为进一步明确豫南烟区是否有烟草青枯病的发生以及发生情况,2014年从信阳市罗山县、驻马店市确山县和遂平县共采集25个疑似青枯病烟草病样和10份病土进行了详细研究。
1.1烟草青枯病的田间调查与样品采集
2014年7—8月,田间调查烟株茎下部黑色坏死病株的发生情况,分别从河南省信阳罗山县、驻马店确山县和遂平县烟区采集到疑似青枯病病株以及病株根际土壤样品共35个。
1.2烟草青枯菌的分离培养与菌落形态观察
采用组织捣碎稀释法进行病原分离[6],在TTC培养基上,28 ℃条件下培养48 h后,观察菌落形态。典型的青枯雷尔氏菌落形态为中央呈粉红色、周围乳白色、流动性较强[7]。挑取典型菌落进行划线纯化培养,纯化3次后用灭菌水悬浮菌体于室温下保存,同时配置成含30%甘油的菌液于-20 ℃条件下保存。
1.3烟草青枯菌的分子鉴定
使用细菌基因组提取试剂盒提取分离菌的基因组DNA,根据郭淼淼等[8]报道的特异性扩增青枯病菌16SrDNA ITS保守序列的引物对RaITS-1/2以及特异性扩增致病性相关基因fliC基因片段的引物对RalfliC-F/R进行烟草青枯病菌的分子鉴定。PCR产物的纯化和测序由上海生工生物技术有限公司完成,将所得序列通过NCBI网站的Blast程序与GenBank中核酸数据进行比对分析。
1.4青枯菌的回接试验
挑选代表性菌株,将保存的菌液在NA平板上划线活化,28 ℃ 培养36~48 h,将菌苔刮下,用无菌水配成浓度为3×108cfu/mL 的菌悬液用于接种。在温室内盆栽烟草品种K326漂浮苗,成活后用刀伤根,每株灌菌悬液10 mL,以灭菌水为对照。每菌株接种3株,常规方法管理。接种后每隔3 d 观察症状。在烟株表现茎部和下部叶片黑色坏死后,取样分离青枯菌。
2.1豫南烟区烟草青枯病的发生危害
田间调查结果表明,烟草青枯病在信阳罗山县、驻马店确山县和遂平县烟区的个别地块发病率较高,达到80%左右,严重的地块出现大面积死亡。烟草青枯病的田间诊断主要通过外观症状和剖秆检查相结合来确定(图1),发病烟株的叶片萎蔫下垂,自下而上变黄、枯死;在茎秆上形成黑色病斑向上延伸,造成烟株半边萎蔫死亡;用刀横切茎基部,会发现维管束变褐,将变褐的维管束切一小段放在盛有清水的瓶中,3~5 min后对光观察,发现有云雾状的乳白色菌脓从切口中冒出,可初步判断为烟草青枯病症状。
图1 烟草青枯病大田危害症状及样本采集Fig. 1 Disease symptoms of tobacco bacterial wilt in the field and sample collection
2.2烟草青枯菌的分离与鉴定
从罗山、确山和遂平3个县的烟田采集的35个样本中分离到青枯菌菌株26个。分离菌在TTC平板上稀释培养48 h后,出现2种不同的菌落(图2),一种是中心呈粉红色的稀液状菌落,有较宽的白边,不规则形或近圆形,流动性强,呈典型的青枯雷尔氏菌菌落形态;另一种菌落呈圆形、光滑、干燥、较扁平、玫瑰红色,白边较窄。其中,典型的青枯菌菌落占总菌落数的80%以上。
分别利用特异性引物对RaITS-1/RaITS-2和Ralflic-F/Ralflic-R[8]对26个分离菌的基因组DNA进行PCR扩增,得到预期产物大小分别为145 bp和724 bp的特异性条带(图3)。将测序所得的序列与NCBI数据库中的Ralstonia solanacearum基因组序列进行Blast比对,相似度达到98%以上。由此可以证明,分离纯化得到的菌株确实为烟草青枯病菌。
图2 烟草青枯病菌在TCC平板上的菌落形态Fig. 2 Colony appearance of Ralstonia solanacearum on the TTC plate
图3 烟草青枯病菌特异性引物对部分扩增结果Ralflic-F/R(A)和RaITS-1/2(B)Fig. 3 Partial amplification results of specific primers Ralflic-F/R(A)and RaITS-1/2(B)for Ralstonia solanacearum
2.3烟草青枯菌的致病性测定
对分离鉴定得到的烟草青枯病菌进行回接试验,接种后10 d,烟苗表现出典型的青枯病症状(图4):烟株一侧叶片萎焉下垂,下部叶黄化萎焉,茎的一侧出现黑色坏死,同时也检测到病组织的喷菌现象。病组织在TTC培养基上也同样分离得到典型的青枯菌菌落。回接试验结果表明,分离到的烟草青枯病菌具有致病性。
图4 烟苗接种不同青枯菌菌株的发病症状Fig. 4 The disease symptoms of tobacco inoculated with different Ralstonia solanacearum strains
烟草青枯病属于高温高湿型病害,广泛分布于全世界的热带、亚热带和一些温暖地区[9]。青枯病的发生与气候条件、土壤、栽培品种等有着密切关系[10-12]。河南信阳市地处江淮两大流域的分界线,是亚热带向暖温带的过渡区,与北邻的驻马店确山县在六、七月份高温高湿多雨,而此时正值烟草打顶抹杈时期,极易造成烟草青枯病的发生。田间调查发现,发病地多为连作烟田,种植品种为中烟201或云烟87,而云烟87为高感青枯病品种[13],且发病烟田土壤偏酸性,这些都为烟草青枯病的发生提供了有利条件。
烟草青枯病、黑胫病和镰刀菌根腐病病株的茎基部都为黑色坏死,且都为土传病害,通常复合侵染,相互之间会加重症状[14-15]。本文只对烟草青枯病菌进行了分离鉴定,对其他根茎类真菌病害是否具有复合侵染未做研究。
初次分离的烟草青枯菌在TTC培养基上出现两种菌落,流动性强、有粉红色中心的大白色菌落具有致病力,这与前人的研究结果一致[7,16-17]。但值得注意的是,不同菌株之间的致病性表现出一定的差异,这可能与菌株在不同地区的适应性及菌种的生理分化有关[18-20]。
烟草青枯病在河南信阳、驻马店等夏季高温多雨地区确有发生,其中信阳罗山县、驻马店确山县和遂平县烟区的个别地块发病率较高,达到80%左右,严重的地块出现大面积死亡,初步确定了豫南烟区烟草青枯病的发生危害情况,同时,通过回接试验证明了烟草青枯病菌为致病菌。
烟草青枯病为细菌病害,与镰刀菌根腐病、黑胫病等真菌病害的田间防治药剂不同。因此,需要根据烟草品种的抗性、病害种类确定药剂防治措施。
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中图分类号:S435.72
文章编号:1007-5119(2015)03-0086-04
DOI:10.13496/j.issn.1007-5119.2015.03.017
基金项目:河南省农业科学院博士专项“烟草根茎部细菌性病害的病原鉴定及其致病性研究”(2014);河南省农业科学院自主创新项目“河南省烟草病害菌源(毒源)库建设”(2014)
作者简介:李小杰,女,博士,助理研究员,主要研究方向为烟草植保。E-mail:lixiaojie000631@sina.com。
*通信作者,E-mail:wanght3231@163.com
收稿日期:2014-11-05修回日期:2015-05-20
The Disease Survey and Pathogen Isolation of Tobacco Bacterial Wilt in Henan Province
LI Xiaojie, WANG Haitao*, LI Shujun, CHEN Yuguo, LI Chengjun, LI Yanping
(Tobacco Research Institute of Henan Academy of Agricultural Sciences, Xuchang, Henan 461000, China)
Abstract:In 2014, 35 suspected tobacco bacterial wilt disease samples were collected from Luoshan, Queshan and Suiping counties of southern areas in Henan Province and 26 bacterial strains were isolated. The sequence similarity between the 26 strains and the Ralstonia solanacearum in NCBI database was more than 98 percent. Typical symptoms of bacterial wilt were observed when the isolated strains were used to inoculate tobacco and Ralstonia solanacearum colonies were obtained on TTC medium from the infected tissues. All of the above indicated that the isolated strains were pathogen of tobacco bacterial wilt disease. This study showed that tobacco bacterial wilt occurred in southern areas of Henan Province.
Keywords:tobacco bacterial wilt; isolation of pathogenic bacteria; identification