不同生态区域烤烟烟叶香气物质分析

李玲燕，徐宜民，刘百战，王程栋，毕艳玖，刘晓冰，2，杨 凡，王树声

（1.中国农业科学院烟草研究所，农业部烟草生物学与加工重点实验室，青岛 266101；2.中国农业科学院研究生院，北京100081；3.青岛农业大学农学与植物保护学院，青岛 266109；4.上海烟草集团有限责任公司，上海 200082）

不同生态区域烤烟烟叶香气物质分析

李玲燕1，2，3，徐宜民1*，刘百战4，王程栋1，毕艳玖4，刘晓冰1，2，杨 凡3，王树声1*

（1.中国农业科学院烟草研究所，农业部烟草生物学与加工重点实验室，青岛 266101；2.中国农业科学院研究生院，北京100081；3.青岛农业大学农学与植物保护学院，青岛 266109；4.上海烟草集团有限责任公司，上海 200082）

为明确不同生态区域烤烟关键香气物质种类，并依据香气物质对不同生态区域进行分类，采用正己烷常温萃取法和液相-气相-质谱联用技术对不同烤烟风格6个生态区域烤烟烟叶香气物质进行测定。结果表明，不同生态区域烟叶有14种香气物质差异显著，贵州中部山区烟叶中巨豆三烯酮等8种香气物质含量显著高于其他产区。主成分分析表明，巨豆三烯酮、茄酮和降茄二酮是不同风格烤烟的关键香气物质；以贵州中部山区烟叶香气物质的主成分得分排名最高，云贵高原产区排名最低。通过主成分聚类分析将6个生态区划分为3类，第1类以贵州中部山区为主；第2类以秦巴山区为主；第3类以武陵山区为主，而山东产区、东北产区和云贵高原产区的取样点分别在第2、3类中分布。基于烟叶香气物质含量的不同生态区烤烟评价和分类是可行的。

不同生态区域；烤烟；香气物质

我国烤烟按其香气风格分为清香型、中间香型和浓香型三大类，其中，中间香型所占的比例最高。中间香型烟叶产区从云贵高原到长白山麓，产区跨度大，生态条件相差悬殊。不同生态区之间烟叶风格特色差别较大，烟叶质量特色或风格与生态条件、品种、栽培措施、调制方法等多种因素有关［1-4］，其中，生态条件是主要影响因素［5］。生态条件等因素造成的烟叶香气物质含量和比例的差异是烟叶香气风格不同的重要原因［6］。因此，人们围绕烟叶香气物质开展了大量研究。有研究认为，烟叶中新植二烯和类胡萝卜素降解产物的含量对烟叶香气质量有重要影响［7-8］；王能如等［9］认为大马酮、巨豆三烯酮、茄酮等最能代表我国烤烟主体香味成分；李章海等［10］认为不同产区烟叶香气指数的差异由茄酮、大马酮等主导。综上所述，烟叶质体色素和西柏烷类降解产物对香气质量贡献较大［3，8-9，11］；但由于烟叶香气物质种类的多样性及其与烟叶质量关系的复杂性，目前，烟叶关键香气物质评价指标并未得到广泛认同。为此，本研究以不同风格烤烟生态区烟叶样品为研究对象，分析不同生态区烤烟香气物质的差异，筛选烟叶关键香气物质指标，以期为特色优质烟叶开发和烟叶香型风格产区定位提供理论依据。

表1 不同生态区烤烟取样点信息Table 1 Sampling points information of flue-cured tobacco from different ecological region

1 材料与方法

1.1 供试材料

选取武陵山区、贵州中部山区、秦巴山区、山东产区、东北产区、云贵高原产区6个烤烟典型生态区［12］，以25个有代表性的取样点2011年的C3F烟叶样品共115份为研究材料，如表1所示，样品来源由国家烟草专卖局特色优质烟叶开发重大专项“中间香型特色优质烟叶生态基础研究”课题提供。烟叶样品磨粉制备后用于香气物质测定。

1.2 香气物质含量测定

采用上海烟草集团技术中心改进的正己烷常温萃取前处理方法和液相-气相-质谱联用的测定技术［13］，根据相关研究结果［3，8-9，11］，具体测定茄酮、β-大马酮、β-二氢大马酮、香叶基丙酮、降茄二酮、β-紫罗兰酮、氧化紫罗兰酮、二氢猕猴桃内酯、巨豆三烯酮（1、2、3、4）、3-羟基大马酮、3-氧代-α-紫罗兰醇、新植二烯、3-羟基索拉韦惕酮和法尼基丙酮17种香气物质的含量。

1.3 香气物质测定前处理

称取过60目筛的烟末样品0.2000 g于15 mL螺口试管内，加5 mL正己烷和200 µL α-紫罗兰酮内标溶液（11.2 μg/mL），涡旋振荡1 min，静置过夜，再次涡旋振荡，3000 r/min离心5 min，取上清液1～1.5 mL至色谱样品瓶待测。

1.4 香气物质检测条件

GPC色谱条件：Shodex CLNapk EV-200柱（2.0 mm I D×150 mm，日本昭和）；流动相二氯甲烷；流速0.05 mL/min，进样量20 µL；柱温30 ℃；DAD检测波长254和320 nm；LC切割范围为5.7～7.4 min。PTV条件：衬管填充物为硅烷化玻璃珠（80～100目），进样口初始温度40 ℃，保持9.2 min，恒压模式，进样口初始压力0.5 psi，保持8.5 min，后迅速升为20 psi，脱附温度280 ℃，一直持续到试验结束；分流口4.2 min打开，排空流量100 mL/min，9 min关闭，11.5 min打开，排空流量50 mL/min，吹扫流速50 mL/min。

GC/MS条件：色谱柱DB-5M（0.32 mmI.D×30 mm，膜厚0.25 md.f.）炉温箱初始温度42 ℃，保持11.5 min，以5 ℃/min升到200 ℃，再以10 ℃/min升至280 ℃，保持15 min；MS电离方式EI；电离能量70 eV；传输线温度280 ℃；离子源温度230 ℃；质量范围35～350；溶剂延迟20 min；质谱鉴定采用NIST98和WILEY6.0谱库并联检索。

1.5 数据处理

运用Excel 2010和SAS9.1软件进行数据处理与统计分析，采用广义线性模型进行差异显著性分析，Princomp和Score过程步进行主成分和得分分析及离差平方和法进行聚类分析。

表2 不同生态区域烤烟香气物质含量差异分析 µg/gTable 2 Analysis on the contents of aroma components in tobacco from different ecological regions µg/g

2 结 果

2.1 不同生态区烤烟香气物质含量差异

表2结果表明，不同生态区烟叶中β-大马酮、降茄二酮和β-紫罗兰酮3种香气物质的含量差异不显著，其余14种香气物质至少在两个区域间的含量差异达显著水平。以秦巴山区茄酮含量较高，西南云贵高原产区β-二氢大马酮含量较高，东北产区香叶基丙酮含量较高，贵州中部山区烟叶中的巨豆三烯酮（1、2、3、4）、3-羟基大马酮、3-氧代-α-紫罗兰醇、新植二烯、法尼基丙酮的含量均显著高于其他产区。烟叶香气物质中均以新植二烯的含量较高，β-大马酮、β-二氢大马酮的含量较低；巨豆三烯酮4个同分异构体的含量均表现为巨豆三烯酮4＞巨豆三烯酮2＞巨豆三烯酮3＞巨豆三烯酮1。

2.2 不同生态区烤烟关键香气物质筛选

香气物质之间有复杂的降解转化关系，为了研究这些有一定相关关系的指标，采用主成分分析法筛选不同生态区烤烟关键香气物质，主成分分析特征值见表3。第1主成分方差贡献率为41.24%，第2主成分方差贡献率为23.76%，第3主成分方差贡献率为14.68%，第4主成分方差贡献率为7.88%，前4个主成分的累计方差贡献率达到87.45%。因此，提取这4个主成分基本代表了原变量的特征、差异和相互关系。

4个主成分的载荷矩阵见表4。第1主成分主要由巨豆三烯酮决定，巨豆三烯酮4个同分异构体有较大的载荷，此外，新植二烯的载荷也较大；第2主成分主要由茄酮、降茄二酮决定，β-大马酮、β-紫罗兰酮的载荷也较大；第3主成分主要由氧化紫罗兰酮、二氢猕猴桃内酯决定；第4主成分主要由香叶基丙酮、3-羟基大马酮决定。总体上，第1、2主成分对烟叶香气物质的贡献较大，达64.99%，而第3、4主成分相对贡献较小，说明以质体色素降解产物巨豆三烯酮4个同分异构体为主体的第1主成分和以西柏烷类代谢产物茄酮和降茄二酮为主体的第2主成分对烟叶香气物质有较大贡献。

表3 主成分特征值及方差贡献率Table 3 Eigenvalues of principal components and their cumulative contribution

表4 主成分载荷矩阵Table 4 Principal component loading matrix

2.3 不同生态区烤烟关键香气物质得分

前4个主成分得分见表5。以巨豆三烯酮4个同分异构体为代表的第1主成分得分最高的4个取样点是开阳、余庆、凯里和贵定，均属贵州中部山区；得分最低的4个取样点是房县、威宁、旬阳和兴山，除威宁外，均属秦巴山区。主成分综合得分排名前4位的取样点分别是开阳、凯里、贵定、余庆，均属贵州中部山区；排名最低取样点是威宁，属于云贵高原产区。不同生态区中，贵州中部山区主成分综合得分排名最高，各取样点主成分得分平均值为1.7240；山东产区排名最低，各取样点主成分得分平均值为-0.6477。第1主成分的方差贡献达41.24%，主宰了主成分综合得分的等级，结合不同生态区烤烟香气物质含量方差分析来看，贵州中部山区烟叶的主成分得分排名较高，与该地区烟叶中巨豆三烯酮、新植二烯、法尼基丙酮等含量较高有关。

2.4 不同生态区烤烟关键香气物质聚类分析

采用离差平方和法对不同生态区烤烟关键香气物质进行聚类分析，分析结果见图1，从距离0.150处划分为3类。

第1类包含4个取样点，为贵州中部山区（余庆、凯里、贵定、开阳）4个点，类别间方差分析表明，此类别烟叶中巨豆三烯酮、3-羟基大马酮、3-氧代-α-紫罗兰醇、新植二烯及法尼基丙酮的含量极显著高于类别2、3（P＜0.0001）。除西秀外，贵州中部山区的取样点均集中在这一类中，并明显区分于其他生态区的取样点。

第2类包含8个取样点，其中秦巴山区（旬阳、兴山、房县）3个点，山东产区（临朐、蒙阴）2个点，武陵山区（咸丰）1个点，西南云贵高原产区（盘县）1个点，东北产区（汪清）1个点，此类别烟叶中巨豆三烯酮、3-羟基大马酮和新植二烯的含量较低；茄酮（P＜0.0001）、降茄二酮（P=0.0002）和二氢猕猴桃内酯（P＜0.0001）的含

量极显著高于其他类。第3类包含13个取样点，其中武陵山区（德江、道真、利川、桑植、凤凰、武隆）6个点，云贵高原产区（兴仁、威宁）2个点，秦巴山区（南郑、巫山）2个点，贵州中部山区（西秀）1个点，山东产区（费县）1个点，东北产区（宽甸）1个点，此类别烟叶中茄酮和降茄二酮含量较低，巨豆三烯酮的含量介于第1、2类之间。

表5 标准化后主成分得分Table 5 Principal component scores after standardization

图1 不同生态区烤烟香气物质主成分聚类分析Fig. 1 Clustering figure charged with selected indices of aroma components in flue-cured tobacco from different ecological regions

第1类中只分布贵州中部山区的取样点，并明显区分于其他生态区的取样点，说明中间香型不同生态区的取样点香气物质之间有明显的区别，反映了不同生态区间生态条件的迥异；同一生态区，以武陵山区为例，咸丰取样点位于第2类中，而武陵山区其他6个取样点均在第3类中，说明同一生态区的取样点香气物质之间也有一定的差异，同一生态区的取样点虽然具有生态条件相似的基础，但又在具体小气候和小尺度生态条件上有一定的差异。

3 讨 论

不同生态区烟叶香气物质中有14种香气物质差异显著，说明生态条件对香气物质含量影响显著，很多研究［3，14-15］也佐证了这一观点，但本研究中β-大马酮、巨豆三烯酮等质体色素降解产物的含量较以往研究低，分析原因可能是香气物质前处理方法不同引起的。

本研究认为巨豆三烯酮、茄酮和降茄二酮是影响烤烟风格的关键香气物质；而王能如等［9］认为大马酮、巨豆三烯酮、茄酮（含降茄二酮）等最能代表我国烤烟主体香味成分，虽然本研究和王能如的研究区域、对象和方法都不尽相同，但在巨豆三烯酮和茄酮、降茄二酮是烤烟香气物质关键指标这个观点上相互印证，只是在大马酮作为主体香味成分上存在分歧，分析原因可能是王能如采用的是同时蒸馏萃取（SDE）方法进行前处理，此过程中长时间加热，导致部分香气成分前体物裂解成小分子的大马酮等香气物质，使最终测得的大马酮等含量高于样品实际含量，而本研究前处理为常温萃取法，减少了大分子前体物裂解成小分子物质的可能性，故本研究中β-大马酮含量极低，且不同生态区之间的含量差异不显著，未被认定为不同生态区烤烟关键香气物质。本研究取样点主要集中在传统中间香型产区，所得到的关键香气物质成分对传统中间香型产区有一定的借鉴意义，要全面深入把握烤烟的关键香气物质，有待进一步采用不同产区不同香型风格的样品进行对比研究。

贵州中部山区烟叶主成分得分排名较高，而云贵高原产区排名较低，高低只是对主成分数值大小的排序，仅表示烟叶中巨豆三烯酮等主成分香气物质含量的高低，并不直接代表烟叶质量的高低，烟叶质量是多种物理化学性状的综合体现。

聚类分析结果表明，不同生态区取样点之间既有明显分离，又有所交叉，说明香气物质含量与具体生态条件有关，前人对单一地区烟叶香气物质与生态因子的关系研究认为，巨豆三烯酮含量与土壤有机质及积温条件有关［16-17］；茄酮和降茄二酮含量与日照时数关系密切［18］，下一步应充分发挥本研究取样点广泛的优势，结合生态因子进行分析，从而筛选出影响香气物质含量的关键生态因子。

4 结 论

不同生态区烤烟烟叶香气物质含量差异显著，巨豆三烯酮、茄酮和降茄二酮是中间香型烤烟的关键香气物质，贵州中部山区烟叶香气物质主成分得分和巨豆三烯酮等8种香气物质含量显著高于其他产区。6个生态区为3类，第1类以贵州中部山区为主；第2类以秦巴山区为主；第3类以武陵山区为主，而山东产区、东北产区和西南云贵高原产区的取样点分别在第2、3类区域中分布。

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Analysis of Aroma in Flue-cured Tobacco Leaves from Different Ecological Regions

LI Lingyan1，2，3， XU Yimin1*， LIU Baizhan4， WANG Chengdong1， BI Yanjiu4，LIU Xiaobing1，2， YANG Fan3， WANG Shusheng1*
（1. Tobacco Research Institute of CAAS， Key Laboratory of Tobacco Biology and Processing， Ministry of Agriculture， Qingdao 266101， China； 2. Graduate School of Chinese Academy of Agricultural Sciences， Beijing 100081， China； 3. College of Agriculture and Plant Protection， Qingdao Agricultural University， Qingdao 266109， China； 4. Shanghai Tobacco Group Co.， Ltd.， Shanghai 200082， China）

The main purpose of this study was to explore the key aroma in flue-cured tobacco leaves， and to classify different ecological regions tobacco based on this. Seventeen aroma were analyzed by N-hexane solvent extraction and liquid chromatographygas chromatography-mass spectrometry （LC-GC-MS） method with 115 flue-cured tobacco samples collected from 25 sampling points in six ecological regions. Principal component analysis and cluster analysis were conducted on the determination results of aroma. Results showed that the contents of fourteen aroma components were significantly different among flue-cured tobacco leaves from different ecological regions. Moreover， eight aroma components including megastigmatrienonel in flue-cured tobacco leaves of mountainous areas of central Guizhou were significantly higher than the other regions. Principal component analysis suggested that the key of aroma components in flue-cured tobacco leaves included megastigmatrienonel， solanone and norsolandione. The highest score of principal component was from the mountainous areas of central Guizhou， while the lowest score was from Yunnan， Guizhou plateau production areas. Using principal component-cluster analysis method based on the contents of aroma components in flue-cured tobacco leaves， the six ecological regions tobacco in this study could be divided into three clusters， with the first one represented by the mountainous areas of central Guizhou， the second one represented by the mountainous areas of Qinba， and the third one represented by the mountainous areas of Wuling. In addition， the sampling points of Shandong production areas， Northeast production areas and Yunnan， Guizhou plateau production areas belonged to the second and third cluster respectively. Aroma components can be used in evaluating and classification of flue-cured tobacco from different ecological regions.

different ecological regions； flue-cured tobacco； aroma

TS41+1

1007-5119（2015）03-0001-07

10.13496/j.issn.1007-5119.2015.03.001

国家烟草专卖局特色优质烟叶开发重大专项“中间香型特色优质烟叶生态基础研究”（TS-02-20110012）

李玲燕（1981-），讲师，在读博士，研究方向为烟草品质与生态。E-mail：lilingyan2395@sina.com

*通信作者，E-mail：xuyimin@caas.cn；E-mail：wangshusheng@caas.cn

2015-02-06

2015-04-10