成都地区HPV-33 E6/E7多态性分析

陈祖翼，丁显平，2△，景亚玲，文 强，张 顺，曹 曼(.四川大学生命科学学院遗传医学研究所，特色生物资源研究与利用川渝共建重点实验室，成都 6004；2.重庆市南川生物技术研究院 408400)



·论 著·

成都地区HPV-33 E6/E7多态性分析

陈祖翼1，丁显平1，2△，景亚玲1，文 强1，张 顺1，曹 曼1
(1.四川大学生命科学学院遗传医学研究所，特色生物资源研究与利用川渝共建重点实验室，成都 610041；2.重庆市南川生物技术研究院 408400)

目的 研究四川地区人乳头瘤病毒(HPV)的33 E6/E7基因变异情况,为HPV的防治提供分子水平的数据。方法 用PCR方法扩增HPV阳性患者宫颈刷脱细胞中HPV-33 E6/E7基因,测序并与GenBank的参考序列对比寻找变异位点，对变异进行初步分析。结果 与参考序列相比，成都地区HPV-33 E6基因变异率为56.00%(28/50)，HPV-33 E7基因变异率为54.00%(27/50)。结论 CINⅢ/CC样品中HPV-33 E6/E7 序列变异程度比宫颈炎中更高，序列突变可能增加患宫颈癌风险。

宫颈癌； 人乳头瘤病毒； 变异

人类乳头瘤病毒(HPV)是一种双链闭合环状小DNA病毒，人是其唯一宿主[1]。HPV亚型按照其与癌症的相关性,分为高危型和低危型,其中HPV-16、18、31、33、35、39、45、51、52、53、56、58、59、66、68和73等被认为是高危型,可引发恶性肿瘤[2]。HPV的分布及病毒基因序列的分布都有地域性差异，在不同地区都存在一定的变异株[3]。HPV功能基因核酸变异有可能引起病毒功能区氨基酸的变化，从而改变病毒基因的功能，与病毒的持续感染、肿瘤的发生、发展相关[1,4]。HPV-33在成都地区是排名第4的常见高危亚型，而且其感染率有上升趋势[5-6]。目前国内对于HPV-33的研究很少，本试验调查了成都地区HPV-33 E6/E7序列的突变情况，并对一些突变位点进行了对比分析，旨在为HPV-33感染的防治提供一些流行病学数据。

1 资料与方法

1.1 样品来源 2012～2014年间共收集HPV-33阳性样品50例，其中宫颈上皮内瘤变(CINⅢ)和宫颈癌(CC)样品13例，宫颈炎37例。样品主要通过成都地区部分医院、医师联合采集(样品由四川省肿瘤等医院确诊，由成都妇女儿童、安琪儿、维多利亚女子、金沙、生殖专科、阳光、天府、锦江妇幼、丽人、棕南等医院联合采集)。

1.2 仪器与试剂 PCR扩增仪(杭州朗基公司)，微量移液器(上海大龙医疗设备有限公司)，生物安全柜(安徽航天生物科技公司)，GSG-2000核酸/蛋白凝胶图像分析系统(珠海黑马医学仪器有限公司)，HPV基因提取试剂盒(亚能生物技术有限公司)，Pfu DNA聚合酶(生工生物工程有限公司)。

1.3 引物设计 以Genbank:M12732.1为参考序列，用Primer5设计巢式PCR引物，外引物：前引物5′-AAA AAA GTA GGG TGT AAC CGA-3′，后引物5′-TGC CAC TGT CAT CTG CTG T-3′；内引物：前引物5′-ACG GTG CAT ATA TAA AGC AAA CAT T-3′，后引物5′-CTT CTA CCT CAA ACC AAC CAG TAC A-3′。

1.4 方法

1.4.1 HPV DNA提取 取宫颈细胞保存液1 mL加入离心管，离心吸去上清液，按照试剂盒加入裂解液提取HPV DNA。

1.4.2 PCR扩增 (1)PCR体系：Buffer(含MgCl2)2.5 μL，dNTPs 2 μL，引物各1.25 μL，DNA 聚合酶0.25 μL，DNA样品5 μL，加无菌双蒸水至25 μL。(2)扩增条件：95 ℃预变性5 min;95 ℃变性45 s,53 ℃退火(内引物57 ℃退火)30 s,72 ℃延伸1 min，共35个循环。最后72 ℃延伸5 min。(3)用2%琼脂糖凝胶电泳鉴定PCR产物。其后将样品送生工生物工程有限公司测序。

2 结 果

2.1 HPV-33 E6 研究结果显示与参考序列(Genbank:M12732.1)相比，成都地区HPV-33 E6基因变异率为56.00%(28/50),共检出突变位点15种，其中3种(A272G，T549C，A552C)不导致氨基酸改变。突变A129C(E7D)、A213C(K35N)、G329C(S74T)、A364C(N86H)、G373A(K89N)、A387C(K93N)、G413C(R102T)、A446G(Q113R)、A446T(Q113L)、G508A(G134R)、G542T(R145I)、G544C(E146Q)均导致氨基酸改变。在宫颈癌样品中HPV-33 E6突变率为76.92%(10/13),在宫颈炎样品中HPV-33 E6突变率为48.65%(18/37)。

2.2 HPV-33 E7 研究结果显示与参考序列相比成都地区HPV-33 E7基因变异率为54.00%(27/50)，共检出突变位点13种，突变G612T(D14Y)、G658C(S29T)、G669T(D33Y)、G674T(E34D)、G705A/C706T/A707T(A45I)、C706A(A45V)、G765A/T766C(V65T)、A780T(N70Y)、A792T(S74C)、A862T(Q97L)均导致氨基酸改变。在宫颈癌样品中HPV-33 E7突变率为75.00%(9/12)，在宫颈炎样品中HPV-33 E7突变率为47.37%(18/38)。

3 讨 论

宫颈癌是一种在世界范围内常见的妇女恶性肿瘤，宫颈癌在女性常见恶性肿瘤中排名第2，仅次于乳腺癌，其发病率高达187/1 000 000，高危型HPV持续感染被认为是导致女性宫颈癌最主要的因素之一[2]。世界范围内每年大概有50万新增宫颈癌患者[7]，其中因HPV-33感染导致的宫颈癌占5%[8]。

HPV相对分子质量约为8 000,其基因包括8个开放式阅读框，按功能可分为3个结构域：早期蛋白编码区(ER)、晚期蛋白编码区(LR)和上游调控区(URR)[1]。E1和E2为调控蛋白，调控转录和复制，E4与病毒成熟胞浆蛋白有关；早期蛋白E5、E6、E7为原癌基因，行使调控细胞转化的功能；L1和L2基因分别编码HPV的主要衣壳蛋白和次要衣壳蛋白，组装成HPV的衣壳；URR位于E区与L区之间，序列保守性较小，含有病毒基因组DNA的复制起点和基因表达所必需的调控元件[9]。 E6和E7是HPV最重要的两个功能基因，高危型HPV的E6蛋白能抑制p53的活性，E7能使细胞往永生化方向转化[10]。HPV E6和E7序列变异会在一定程度上改变蛋白的功能，增强或减弱病毒的致病性[3,11]。宫颈癌的发生与病毒的变异、病毒的持续性感染和反复感染、病毒DNA 拷贝数以及机体的免疫状态等因素相关，高危型HPV功能基因变异与病毒的持续性感染和反复感染以及病毒DNA 在宫颈癌组织中的高拷贝数相关[3,12]。从试验结果中发现，HPV-33 E6/E7基因在宫颈癌中的突变率与在宫颈炎中的突变率不同且前者高于后者，且在宫颈炎和CINⅢ/CC中不同病毒株的检出比例也不尽相同，说明基因突变会使HPV E6/E7基因的致癌性改变。

一项研究统计了全球性的HPV-33 E6/E7序列分析(其中中国只有6例阳性样品)[11]，其结果与成都地区序列变异调查结果差别较大，E6基因中共同存在的突变位点只有A213C和A273G，而E7基因的突变经对比则没有发现相同位点，提示HPV-33变异序列的分布有地域性差异。

一些研究显示存在I73L、V83L、K93N和A138V的HPV-33 E6基因在抑制p53活性的能力上更加突出[13]，本研究中仅发现了K93N(A387C)的突变位点。对于HPV-33 E6基因，除了K93N，值得注意的还有K35N、N86H、E89K、R102T、Q113R和R145I，存在这些变异的病毒株在宫颈癌样品中的检出数都明显高于在宫颈炎样品中的检出数。对于HPV-33 E7基因，值得注意的是D14Y、S29T、A45V、A45I、V65T、N70Y和Q97L，存在这些变异的病毒株在宫颈癌样品中的检出数都明显高于在宫颈炎样品中的检出数。

成都地区HPV-33 E6/E7基因变异程度较高，在研究例如RNA干扰等针对HPV E6/E7 基因的治疗手段时，需要考虑针对优势变异株如E6 G542T 的碱基改变进行治疗效果的优化。

HPV变异株数据库对于其诊断、疫苗制备及其他治疗方法的研究都具有深远意义。本试验针对中国成都地区HPV-33亚型E6和E7基因进行了多态性分析。该数据补充并拓展了早期对HPV-33亚型的研究。在以后的研究中，将会扩大样本量，做一个更全面的关于HPV-33基因突变带来的致癌性改变的评估。

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Analysis on HPV-33 E6/E7 polymorphism in Chengdu area

CHENZu-yi1,DINGXian-ping1,2△,JINGYa-ling1,WENQiang1,ZHANGShun1,CAOMan1
(1.ResearchInstituteofGeneticMedicine,SchoolofLifeScience,SichuanUniversity,Bio-ResourceResearchandUtilizationJointKeyLaboratoryofSichuanandChongqing,Chengdu,Sichuan610041,China; 2.NanchuanBiotechnologyAcademy,Chongqing408400,China)

Objective To investigate human papillomavirus(HPV)33 E6/E7 gene variation in Chengdu area to provide the molecular level data for the prevention and treatment of HPV infection.Methods The HPV-33 E6/E7 genes in cervical exfoliated cells from the patients with HPV positive were amplified by PCR.The results were sequenced and compared with referencel sequence in GenBank for finding the mutant sites.Then the variations were preliminarily analyzed.Results Compared with the reference sequence,the variation rate of HPV-33 E6 in Chengdu area was 56.00%(28/50) and which of HPV-33 E7 was 54.00%(27/50).Conclusion The variation degree of HPV-33 E6/E7 in CINⅢ/CC sample is higher than that in cervicitis,the sequence mutations may increase the risk suffering from cervical cancer.

cervical cancer; human papillomavirus; variation

陈祖翼,男,在读博士,硕士,主要从事医学分子检验技术研究。△

，E-mail:brainding@scu.edu.cn。

10.3969/j.issn.1672-9455.2015.22.027

A

1672-9455(2015)22-3364-02

2015-05-16

2015-09-23)