可见光诱导视网膜神经节细胞凋亡机制的研究进展

杨晓伟 综述，桑爱民 审校

（南通大学附属医院眼科，江苏226001）

·综 述·

可见光诱导视网膜神经节细胞凋亡机制的研究进展

杨晓伟 综述，桑爱民 审校*

（南通大学附属医院眼科，江苏226001）

视网膜退行性疾病和光损伤动物模型中的视网膜有着共同的特点：视觉细胞的凋亡。探究视觉细胞的凋亡机制可能让我们更好地理解视网膜退行性疾病，为视网膜疾病导致失明的治疗提供策略。先前研究表明，过量的光照将会造成视网膜的损伤，引起视网膜细胞损伤和结构破坏。主要表现为视网膜光感受器细胞的凋亡。近年来研究发现，神经节细胞在强光的照射下亦可发生凋亡。然而，光导致的视网膜神经节细胞的损伤机制还有待进一步研究。本文将国内外视网膜光损伤后神经节细胞凋亡的机制研究进展作简要的综述。

光损伤；视网膜神经节细胞；凋亡

随着社会的发展，人工照明设备应用的范围越来越广，光污染成了影响我们健康的危险因素之一[1]。早在柏拉图时代视网膜光损伤的概念就被提出，直到1966年Noell等才将视网膜光损伤模型应用于研究[2]。近年来，随着眼科光学诊疗器械的发展和眼科显微手术应用的增多，各种光源所致视网膜损伤问题也越来越引起人们的重视[2-3]。视网膜光损伤是指环境中过量的光照射眼睛而诱导视网膜的损伤。在一些常见的视网膜变性疾病中，如年龄相关的黄斑变性（age related macular degeneration，AMD）、视网膜色素变性（retinitis pigmentosa，RP）等与视网膜光损伤有相似的病理形态学改变，因此，视网膜光损伤是研究AMD良好的动物模型[4]。先前研究表明，过量的光主要是通过损伤光感受器细胞和色素上皮细胞而导致视网膜损伤[5-6]。而近年来研究发现，过量的光照射视网膜同样可以诱导视网膜神经节细胞（retinal ganglion cell，RGC）的凋亡[7-11]。尤其在青光眼、糖尿病视网膜病变等RGC功能受到累及的疾病中，过量的光照是影响RGC存活的危险因素之一[12]。众所周知RGC在视觉形成及传输过程中起着重要作用。在视网膜仿生学研究中，研究者发现利用电刺激视网膜可以有限度地挽救RP等视网膜疾病所致的失明，然而RGC损伤后视力则不能恢复[13]，提示维持正常RGC的功能是我们将来为治疗不可逆性眼盲寻找策略的前提。因此，探究光诱导的RGC凋亡的分子机制可能对治疗视网膜疾病提供新的理论依据和分子靶点。本文将国内外视网膜光损伤后神经节细胞凋亡的机制研究进展作简要的综述。

1 视网膜重塑过程中RGC凋亡

视网膜病变过程中出现一系列神经元和神经胶质细胞的重塑改变，这种视网膜结构的改变进一步加重了视网膜的损伤，影响预后[14]。在视网膜重塑过程中，视网膜光感受器，包括视杆、视锥细胞首先凋亡丢失，继而视网膜正常结构破坏，残余的神经视网膜重塑，神经节细胞凋亡，胶质细胞活化迁移、增殖以及纤维化，新生轴突和突触的加工以及神经传导通路重构。视网膜重塑是导致细胞死亡、空间结构破坏、结构稳定性消失、突触连接重建、传导通路重布等一系列消极的复杂的不利于信号传输改造过程[14]。在遗传性的光感受器视网膜疾病模型中，研究者发现，光感受器细胞确实死亡殆尽之时，RGC细胞出现退行性改变，提示RGC损伤是由于视网膜重塑造成的[15-18]。研究者发现视紫红质突变的P23H-1大鼠模型中，随着大鼠年龄增加，光感受器受损从外周视网膜开始直至整个视网膜。研究者通过逆行荧光标记以及RGC特异性标记Brn3a计数RGC数目，发现与SD大鼠相比P23H-1大鼠RGC数目明显减少。与此同时，研究者发现RPE迁移进入视网膜形成RPE-血管复合物，RGC神经轴突牵拉受损，最终导致RGC的凋亡[18]。视网膜光损伤模型主要表现为过量光照射后视网膜光感受器细胞的凋亡。视网膜光损伤后至少包含两个主要的病理过程：早期急性视网膜损伤和晚期视网膜病变。在光损伤早期，视网

膜损伤主要是光感受器细胞的凋亡，尤其是在颞上侧光敏感区域。晚期，这些视网膜损伤的区域血管出现渗漏，视网膜色素上皮细胞迁移并包裹深血管丛形成复合物，继而影响RGC轴突的功能，最终导致RGC的凋亡[17，19]。这与在遗传缺陷大鼠中的观察研究是一致的。因此，光诱导的RGC凋亡可能是继发于光感受器细胞缺失后视网膜重塑过程中机械的牵拉以及对RGC轴突的挤压。因此，在视网膜退行性疾病中抑制视网膜结构重塑是减缓视网膜退行性变的治疗策略之一。

*[通信作者]桑爱民，E-mail：sangam@ntu.edu.cn

胶质细胞的活化在视网膜重塑过程中扮演着重要角色。急性视网膜光损伤可以激活视网膜中的胶质细胞，活化的角质细胞增殖、迁移、纤维化以及分泌促炎因子，继而损伤RGC[20-21]。抑制视网膜胶质细胞的活化可以减少视网膜兴奋性毒性导致RGC凋亡[22]。提示我们光损伤后RGC的凋亡受到活化的胶质细胞的调节。光损伤后胶质细胞活化与RGC凋亡的具体机制还有待进一步研究。

2 线粒体途径诱导的凋亡

线粒体是细胞有氧呼吸和代谢的重要细胞器，在细胞生长、增殖、分化和死亡等生命活动中扮演着十分重要的调控者角色。在中枢系统神经元中，线粒体参与多种生理活动，包括能量代谢、细胞内钙离子的稳态和细胞的信号传导，调节神经元的兴奋性。随着年龄增长或有害因素刺激下神经元的线粒体功能受损，继而导致神经退行性疾病的发生[23]。线粒体主要的功能是氧化磷酸化，而氧化磷酸化是细胞能量产生的主要途径。作为联系大脑与视网膜的神经元，RGC同样是机体能量需求及相对耗氧率最高的组织之一，其线粒体含量很高，以提供其动作电位传导及轴突运输所需能量。然而，视神经中线粒体的分布密度是不均匀的，在无髓鞘区线粒体的密度远远比筛板后高，这与其功能结构特点及能量需求是相对应的。这些无髓鞘的轴突通过桥粒或半桥粒样结构与其他轴突和胶质细胞联接。这些富含线粒体的轴突区域维持RGC正常的信号传输[24-25]。线粒体损伤后除了影响细胞ATP的产生外，还能间接地影响细胞内蛋白和细胞钙离子的平衡。除此之外，线粒体功能障碍进一步产生额外的ROS增加细胞损伤。

那么光是如何影响线粒体的呢？光可能直接作用于线粒体感光剂而影响线粒体功能。线粒体的许多组成成分具有吸收特定光谱的作用，包括如细胞色素氧化酶（COX）、细胞色素P450和黄素蛋白类。因此，线粒体中黄素以及色素氧化酶类使得线粒体成为光照后容易受损的细胞器[26]。研究发现，与暗环境中的细胞相比，光照减弱了细胞线粒体中脱氢酶的活性和线粒体的氧化还原反应，声波降解线粒体后可以减少光诱导的细胞的上述改变。因此，光线直接作用于线粒体而下调其代谢水平。氧化磷酸化是神经元能量来源的主要方式，维持着细胞正常功能。氧化磷酸化复合体包括复合体I～V，电子通过复合体I或II进入呼吸链，参与氧化还原反应。RGC-5光照后，免疫蛋白印记检测发现复合体III、IV和V蛋白表达量明显上调，然而复合体II却有轻微的下调[7]。提示光可能通过直接影响氧化磷酸化复合体抑制了呼吸链中电子的传递。另外，研究者发现，RGC-5线粒体的膜电位改变，线粒体形态改变。暗环境中RGC-5细胞的线粒体是细长型，然而，1000Lx光照48小时后线粒体形态上变成点状。同时在胞浆中检测到细胞色素c，提示线粒体再光照后，线粒体膜的通透性增高，线粒体功能受损[7]。另有研究显示，光诱导的RGC的凋亡与RGC的状态有关，体外实验表明RGC在无血清培养基中更容易受到光损伤，在青光眼等RGC受到累及的视网膜疾病中，光照后，RGC更容易受到影响[12]。因此，有害因素刺激下视网膜内环境平衡的紊乱可能是RGC易受光损伤的机制之一。

3 DNA损伤诱导的凋亡

DNA损伤会诱发细胞多种反应，包括DNA修复、细胞周期阻滞、细胞凋亡等，严重的DNA损伤导致修复失败将最终导致细胞凋亡。体内外各种因素的刺激，例如：外源性的紫外线、高温高压、射线、重强氧化剂、金属、强碱和强酸等物理化学因素和内源性ROS、酸碱不平衡及DNA在复制过程中出现的错误等，都可以导致DNA损伤。大量研究表明，ROS能够引起氧化损伤，并引起包括DNA链断裂、DNA位点突变、DNA双链畸变等形式的DNA损伤，不仅如此，DNA损伤可以提升细胞内ROS水平，说明DNA损伤和ROS引起的氧化应激之间存在着一定的联系[27]。在光诱导的视网膜损伤中，ROS扮演着重要角

色[28]。因此，光照可能导致RGC的DNA损伤，继而诱导其凋亡。研究表明，细胞核DNA的损伤可以迅速诱导PARP-1的活化，在结合损伤的DNA后，PARP-1的活性增加了近500倍，并且催化ADP转化聚合到PARP-1和组蛋白、拓扑异构酶I和II等核蛋白上[29]。研究发现，PARP-1在光诱导的RGC-5细胞死亡信号途径中发挥着关键性作用，抑制PARP-1可以明显保护光损伤中的RGC-5细胞。他们发现应用PARP-1抑制剂NU1025明显缓解RGC-5光损伤作用。

细胞凋亡诱导因子（apoptosis inducing factor，AIF）是线粒体膜间隙中的黄素蛋白。在正常情况下，可以作为线粒体的氧化还原酶，对细胞色素C和烟酰胺腺嘌呤二核苷酸（NAD）之间的电子传递起到催化作用。AIF具有线粒体定位信号和核定位信号序列，当细胞受到凋亡刺激的时候，AIF可以透过线粒体膜进入到细胞浆中，再通过核定位信号序列引导转位到细胞核内，引起染色质的固缩和DNA大规模的片断化，与PARP-1的激活有关[30]。研究发现AIF作为PARP-1的下游因子在2600lx光照射后由细胞浆转位到细胞核，同时发现AIF抑制剂LNP可以提高细胞活性。这些实验结果表明光照射激活了AIF，AIF参与了光诱导的细胞死亡信号机制，通过抑制AIF可以有效地减弱光诱导的RGC-5细胞的凋亡[9]。

Ca2+作为细胞内一个重要的第二信使，调节细胞多种功能，包括细胞死亡。Ca2+激活了NOS产生大量NO，导致DNA的氧化损伤，引起PARP的活化并启动PARP-1依赖的细胞死亡信号途径。光照射可以引起PARP-1过度活化，并合成大量的PAR，而PAR的水解产物ADP核糖可以激活钙离子瞬时受体电位通道引起Ca2+的内流，进而触发多种信号级联反应导致细胞死亡[31-32]。通过应用Fura-2荧光指示剂证实了Ca2+的内流，与对照组相比光照射3天后细胞内Ca2+浓度提高了近10倍[9]。此外他们也发现应用Cobalt（Ca2+通道阻滞剂）可以部分减少细胞死亡，提示Ca2+的紊乱参与光导致的DNA的损伤。

4 其它分子机制介导的凋亡

在先前的研究中，我们发现应用16 000Lx高强度光照持续照射大鼠2小时后，Western bolt检测发现大鼠视网膜中Dexras1在光照后6小时开始增加，1天达到峰值，7天降到正常水平。免疫荧光检测发现表达增加的Dexras1与活化的caspase-3以及nNOS、nNOS的配体都在RGC上表达，应用一氧化氮合酶抑制剂可以下调活化的caspase-3的表达。提示光照后Dexras1通过nNOS途径参与RGC的凋亡[33]。转录因子（transcription factor，TF）是一类能与特异性DNA序列结合并调节基因转录的调控蛋白。转录因子通常是细胞内信号通路的核心蛋白，是将外界刺激转化为基因表达变化的关键调控者。在光诱导的RGC凋亡分子机制的研究中，研究者发现CREM-1（cAMP反应元件调节因子1）在RGC上高表达。CREM-1参与纹状体的发育以及脊髓损伤的病理发展过程，提示CREM-1在神经损伤中可能扮演着重要角色。研究者发现CREM-1与参与调节光诱导的RGC的凋亡然而具体机制还有待进一步阐明[34]。另外，转录因子TFIIB（转录起始因子IIB）在光损伤后参与RGC的凋亡，其机制可能是通过其下游分子p53对细胞周期的调控而实现的[35]。

细胞周期调控在细胞凋亡的机制中具有重要地位。研究表明终末分化的神经细胞在有害刺激条件下可以再进入细胞周期，继而诱导细胞的凋亡。那么，该机制是否也存在与RGC中呢？研究者发现视神经夹伤后，RGC重新进入细胞周期到达S期检查点，随后DNA超倍化的细胞发生凋亡，细胞周期调控蛋白cyclin A、Ski相互作用蛋白（ski-interacting protein，SKIP）在RGC中高表达[36-37]。提示RGC再进入细胞周期调控参与其凋亡的发生。在光损伤模型中，研究者发现细胞周期调控蛋白cyclin D1、CDK4在RGC中高表达。提示我们RGC再进入细胞周期调控机制可能也参与光诱导的RGC的凋亡。但其具体机制需要做进一步研究。

视网膜光损伤的机制研究虽取得了一定的进展，但其根本机制仍然有待深入探讨。近年来，光诱导的RGC的凋亡受到研究者的重视。探索RGC的凋亡的分子机制可能为干预和治疗不可逆性盲提供理论依据和分子靶点。

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