阿莫西林克拉维酸钾亚最低杀菌浓度体外诱导细菌耐药研究

陈荣剑，祝仲珍，王占科，袁小兰，胡新华，宁丽萍，兰小鹏

近年来，随着住院患者抗菌药物不合理使用现象日益严重，促进和诱导了细菌耐药的发生，研究导致细菌耐药原因和机制已引起国内外高度重视［1-3］。有文献报道，低剂量氟喹诺酮类药物可体外诱导从临床感染患者标本中分离出来的大肠埃希菌菌株发生细菌耐药现象［4］，但低剂量抗菌药物浓度体外诱导标准菌株耐药性的研究报道国内外不多见。金黄色葡萄球菌是外科感染患者的常见致病菌，也是医院内感染的常见菌［5］，阿莫西林克拉维酸钾是临床上治疗感染的常用抗菌药物［6］。虽然金黄色葡萄球菌标准菌株对阿莫西林克拉维酸钾敏感，但患者感染的金黄色葡萄球菌菌株普遍存在耐药现象［7-9］。为此，本文以金黄色葡萄球菌标准菌株为研究对象，通过阿莫西林克拉维酸钾亚最低杀菌浓度(minimal bactericidal concentration，MBC)体外多步诱导培养，观察金黄色葡萄球菌标准菌株MBC值变化，旨在证明MBC抗生素可诱导细菌耐药的发生，为临床合理使用抗生素剂量提供试验依据，现报告如下。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 标准菌株:金黄色葡萄球菌标准菌株ATCC 29213，由江西省临床检验中心提供。

1.1.2 抗菌药物:阿莫西林克拉维酸钾，规格为1.5 g/支，阿莫西林:克拉维酸钾为4∶1，批号为20140316，有效期为2年，购自华北制药集团有限公司。

1.1.3 主要试剂和设备:M-H肉汤细菌培养液，批号为20140318，有效期为3年，购自郑州安图绿科生物工程有限公司;M-H琼脂固体培养平板，规格为直径9 cm，批号为20131124B，购自郑州安图绿科生物工程有限公司。系列麦氏标准比浊管，购自梅里埃诊断产品(上海)有限公司;LRHS-100型37℃恒温培养箱，购自上海跃进医疗器械有限公司。BSC1500RIB2X型生物安全柜，购自济南博科生物技术有限公司。WALK AWAY 40SI型全自动药敏鉴定分析仪及药敏板条，均购自上海西门子医疗器械有限公司。

1.2 方法

1.2.1 标准菌株液制备:在生物安全柜中，金黄色葡萄球菌标准菌株解冻后，无菌操作条件下，将标准菌株接种在M-H琼脂固体培养平板复活，然后接种环取少许菌落，接种于不含抗生素的M-H肉汤培养液中，37℃培养24 h后，用麦氏标准管调整菌液浓度为 1 ×105cfu/ml，备用。

1.2.2 微量稀释法测定MBC:用抗菌药物微量稀释法测定金黄色葡萄球菌标准菌株MBC［10］。在生物安全柜内，无菌操作，首先用M-H细菌培养液对阿莫西林克拉维酸钾分别进行倍比稀释，分别加入12×8孔聚苯乙烯无菌微孔培养板中，然后再分别加入金黄色葡萄球菌标准原始菌株或诱导菌株，使抗菌药物终浓度分别为 1024、512、256、128、64、32、16、8、4、2、1 和 0．5 μg/ml，金黄色葡萄球菌标准原始菌株或诱导后菌株终浓度为1×105cfu/ml。同时，设空白对照孔和生长对照孔，空白对照孔加MH细菌培养液，但不加细菌液;生长对照孔加细菌液和M-H细菌培养液，但不加抗菌药物。微孔细菌培养板37℃培养24 h后，肉眼观察微孔内细菌生长情况，取清晰透明底部无沉淀微孔细菌培养液，三线法接种在M-H琼脂固体培养基，培养24 h后，观察有无细菌生长。M-H琼脂固体培养基上无细菌生长的最小抗生素浓度为MBC。为减少MBC测定试验误差以及确保亚MBC药物浓度诱导，避免误使用MBC药物浓度导致细菌全部杀死造成诱导终止和失败，本试验同一菌株平行测定5次，MBC值均发生变化，才被认定诱导后菌株MBC变化值。

1.2.3 MBC抗菌药物多步诱导耐药菌株:首先用微量稀释法测定抗菌药物MBC，测定金黄色葡萄球菌标准原始菌株MBC值，记为MBC0。取10μl金黄色葡萄球菌标准原始菌株(MBC0)加入5．0 ml MH液态培养基中，调整阿莫西林克拉维酸钾终浓度为1/2 MBC0，37℃诱导培养24 h，测定诱导后菌株MBC值，如果MBC值没有变化，保持抗菌药物浓度不变，继续诱导培养细菌，每天均测定MBC值，并观察有无变化。如果经多次诱导培养后菌株MBC值发生变化，记作MBC1，改变抗菌药物诱导终浓度为1/2 MBC1，继续诱导培养，继续每天测定MBC值。如果多次诱导培养后，菌株MBC值又发生变化，再记作MBC2，改变抗菌药物终浓度为1/2 MBC2，再继续诱导培养。以此类推，阿莫西林克拉维酸钾诱导组连续诱导35 d，每天测定并记录MBC变化值及其诱导变化时间。

1.2.4 诱导后耐药菌株的鉴定:本组试验诱导出的耐药菌株(MBC升高10倍以上)，经不含任何抗菌药物M-H液态增菌培养基，稳定传代3次，用麦氏标准管调整菌液浓度为1×105cfu/ml(0．5个麦氏单位)，经WALK AWAY 40SI型全自动西门子药敏鉴定分析仪，自动判断对阿莫西林和阿莫西林克拉维酸钾的耐药性，重复测定10次，并与诱导前标准菌株耐药性进行分析。

2 结果

2.1 亚MBC阿莫西林克拉维酸钾不同诱导时间对金黄色葡萄球菌耐药性的影响 金黄色葡萄球菌ATCC 29213标准菌株阿莫西林克拉维酸钾MBC0值为2．0 μg/ml，通过1．0 μg/ml(1/2 MBC0)阿莫西林克拉维酸钾浓度诱导10 d发现，金黄色葡萄球菌ATCC 29213标准菌株阿莫西林克拉维酸钾MBC升高到4．0μg/ml(MBC1)。第11天开始，阿莫西林克拉维酸钾诱导剂量升高到 2．0μg/ml(1/2 MBC1);继续诱导到18 d，结果发现，金黄色葡萄球菌阿莫西林克拉维酸钾MBC升高到8．0μg/ml(MBC2)。第19天开始，阿莫西林克拉维酸钾诱导剂量再升高到4．0μg/ml(1/2 MBC2);继续诱导到25 d发现，金黄色葡萄球菌阿莫西林克拉维酸钾MBC升高到16．0μg/ml(MBC3)。以此类推，继续增加阿莫西林克拉维酸钾诱导剂量发现在诱导后30和35 d金黄色葡萄球菌阿莫西林克拉维酸钾MBC 升高到32．0μg/ml(MBC4)和 64．0 μg/ml(MBC5)。本组试验数据表明，随着亚MBC阿莫西林克拉维酸钾诱导时间增加，金黄色葡萄球菌菌株耐药性增强，经过35 d诱导细菌耐药性增加了32倍。

2.2 诱导出的耐药菌株对阿莫西林克拉维酸钾耐药率 本组试验诱导出的金黄色葡萄球菌耐药菌株，经全自动细菌药敏鉴定分析仪进行药敏鉴定，结果发现对阿莫西林克拉维酸钾耐药率为100%，而原始菌株耐药率为0。

3 讨论

临床患者、包括普通外科感染患者不合理使用抗菌药物，不仅包括使用抗生素种类不合理，经验用药严重，而且也包括使用剂量不合理，剂量使用过小或过大，抗菌药物使用种类不合理和抗菌药物使用剂量不合理可能是导致细菌耐药的主要原因［11］。金黄色葡萄球菌标准菌株常用于临床微生物实验室细菌药敏试验质量控制，标准菌株表现为对某种抗菌药物存在天然敏感或耐药［12］。本试验采用亚MBC抗菌药物诱导的菌株为金黄色葡萄球菌ATCC 29213标准菌株，其阿莫西林克拉维酸钾MBC值为2．0 μg/ml，最小抑菌浓度(minimum inhibitory concentration，MIC)为 1．0 μg/ml，说明金黄色葡萄球菌ATCC 29213标准菌株对阿莫西林克拉维酸钾均敏感。本组研究结果发现，阿莫西林克拉维酸钾诱导金黄色葡萄球菌ATCC 29213标准菌株10 d，MBC值开始升高 1倍，诱导第 18、25、30、35天，金黄色葡萄球菌 MBC值由 2．0μg/ml升高到64．0μg/ml。本试验证明阿莫西林克拉维酸钾亚MBC均可以诱导金黄色葡萄球菌ATCC 29213标准敏感菌株出现耐药现象。

抗菌药物突变选择窗(mutation selection window，WSW)可指导临床合理选择抗菌药物治疗剂量，WSW一般介于抗菌药物的耐药变异预防浓度(mutation prevention concentration，MPC)和 MIC之间［13-15］。值得注意的是，临床上细菌出现耐药现象，并不是突然发生的，细菌从敏感到耐药，有一个渐变的过程，表现为MIC和MBC逐步发生变化。因此，WSW浓度也在变化，这就是本研究每天都要对诱导菌株进行MBC值检测的原因。

本试验通过每天观察被诱导细菌MBC值变化，并不断提高抗菌药物诱导浓度，能诱导出金黄色葡萄球菌标准菌株的耐药菌株，可能原因为:①同一菌株在繁殖过程中存在药物耐药性差异;②亚MBC杀死绝大多数药物敏感细菌后，留下对药物耐药的极少部分“逃逸细菌”株;③“逃逸细菌”株耐药出现遗传学改变可被稳定传代。本组研究结果发现，金黄色葡萄球菌ATCC 29213标准敏感菌株经过连续诱导5次MBC升高，历经35 d最终变成耐药菌株。细菌发生耐药的机制很复杂，不仅涉及细菌耐药质粒的产生、基因的突变、细菌细胞膜改变、药物外输等细菌内部因素，也涉及细菌微环境的改变［16-18］。

本试验研究发现，阿莫西林克拉维酸钾可以成功诱导金黄色葡萄球菌耐药，提示亚MBC诱导细菌耐药的机制复杂，可能涉及细菌外膜通透性改变，阻止抗菌药物进入细菌体内、细菌突变具备药物分子主动外排系统及抗菌药物作用靶点改变等。已有文献报道，亚MIC抗菌药物可通过诱导细菌生物膜形成以及SOS基因损伤修复等机制导致细菌耐药的发生［19-20］。本组研究结果提示，临床长时间低剂量使用抗菌药物可诱导耐药菌株即“逃逸细菌”的发生，临床不仅要合理使用抗菌药物种类，更要重视和合理使用抗菌药物使用剂量。

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