烤烟中性致香物质在烘烤前后的差异分析

赵会纳，蔡 凯，雷 波*，武圣江，任 竹，向章敏，潘文杰，姚珊珊，蔡 斌

（1.贵州省烟草科学研究院，贵阳 550081；2.重庆市烟草公司黔江分公司，重庆409000）

烤烟中性致香物质在烘烤前后的差异分析

赵会纳1，蔡 凯1，雷 波1*，武圣江1，任 竹1，向章敏1，潘文杰1，姚珊珊2，蔡 斌1

（1.贵州省烟草科学研究院，贵阳 550081；2.重庆市烟草公司黔江分公司，重庆409000）

为探求烘烤过程对烤烟中性致香物质的影响，采用顶空固相微萃取-全二维飞行时间质谱联用法和半叶法研究了K326和南江3号烟叶中性致香物质种类、含量及其比例在烘烤前后的差异。结果表明：（1）多种香气物质在烘烤过程中发生了转化，有19种香气物质在烤后烟叶未检测到，但增加了36种香气物质。（2）烘烤后香气物质总量显著增加，且不同品种烤烟香气物质转化程度不同，K326的香气物质总量（不含新植二烯）显著高于南江3号。（3）烘烤后西柏烷类降解产物占中性致香物质总量的比例明显降低，而苯丙氨酸降解产物和类胡萝卜素降解产物所占比例明显提高。在烘烤过程中损失了醛、醇和酯类等19种香气物质，产生了类胡萝卜素降解产物、棕色化反应产物等36种香气物质。

烤烟；顶空固相微萃取-全二维飞行时间质谱联用法；烘烤；品种；中性致香物质

香气物质的组成和含量是衡量烟叶品质的重要指标之一，也是衡量烟叶内在品质和香气状况最直接、可靠的指标［1］。调制过程是烟叶香气前体物降解，香气形成和转化的主要时期［2-4］，在调制期间，伴随着香气前体物的降解及一系列复杂的生理生化反应，许多挥发性致香成分产生或含量增加，但也有一些成分保持稳定或减少甚至消失［5-8］。而目前特色烟叶重大专项研究中物质代谢基础研究主要采用大田鲜烟叶，而化学特征物质以及评价定位研究采用烤后烟叶，研究中使用的烟叶样品状态不同导致研究结果可能脱节，本试验研究烘烤前后烟叶中物质转化及其变化规律，可将三者研究结果有机的结合起来，为解析香型形成的物质代谢途径提供了依据。在致香物质的研究中应用较多的方法有同时蒸溜萃取法（SDE）［9］、溶剂萃取法［10］、顶空共蒸馏法（HCD）［11］和加速溶剂萃取法（ASE）［12］，这些方法操作不仅耗时、且萃取时容易造成部分挥发性香气成分损失或分解变化。而固相微萃取（SPME）是近年来出现的一种新的采样技术，具有操作简便、测定快速、样品用量少、无需溶剂等优点。王璐等［13］采用固相萃取-气质联用的方法分析了烟叶中的致香物质，证实了SPME是一种快速准确分析烟叶中致香物质的方法，而全二维气相色谱（GC×GC）及其与飞行时间质谱（TOFMS）联用是新近发展起来的适合用于复杂体系分析的一种高分辨、高灵敏度的分离鉴定技术［14］。因此本研究采用顶空固相微萃取-全二维飞行时间质谱联用法比较了烘烤前后中性致香物质种类、含量及比例的差异，以期为研究香气物质的前体物及其在烤烟生长过程中的代谢基础以及调控提供基础。

1 材料与方法

1.1 供试材料

试验于2013年在贵州省烟草科学研究院福泉基地进行，供试品种为贵州省主栽品种K326和南江3号。在烟株中部叶成熟采烤前，以第12叶位（从下往上数）为取样对象，采用半叶法将叶片从主脉分开，一半立即液氮冷冻，并采用真空冷冻法干燥；另一半正常烘烤（含主脉）。每个品种取3个重复，每个重复8片。为避免水分含量差异，将烘烤后的烟叶样品去主脉，置40℃恒温干燥箱中烘干至恒重，将烟叶粉碎后过60目筛后低温密封保存备用。

采用散叶密集烘烤的方式进行烘烤，将2个品种烤烟装在同一烤房内相同或相对的位置，放置在烤房第二层（从顶层起），烤房装烟平均密度为75 kg/m3，根据烟叶变化调控烘烤工艺［15］。

1.2 测定方法

1.2.1 真空冷冻干燥方法（1）样品预冻：将烟叶样品在冷冻干燥仪中-20 ℃保持5h；（2）第一阶段升华：在0 ℃下干燥15h；（3）第二阶段升华：在20 ℃下干燥直至样品恒重。将烟叶粉碎后过60目筛后低温密封保存备用。

1.2.2 致香物质测定方法基于动态顶空采用全二维气相色谱飞行时间质谱（GC×GC-TOFMS）测定中性致香物质含量［16］，在贵州省烟草科学研究院分析检测研究中心测定。

1.3 数据分析

采用SPSS16.0软件进行数据分析。

2 结果

2.1 烘烤前后中性致香物质种类差异

烤烟烟叶中性致香物质种类在烘烤前后发生了显著的变化，其中有19种香气物质仅在烘烤前烟叶中检测到，有36种香气物质仅在烘烤后烟叶中检测到，另外还有23种香气物质在烘烤前后烟叶中均检测到。

2.1.1 烘烤前独有的致香物质从表1可知，仅在烘烤前烟叶中检测到的19种致香物质主要是一些醛、醇和酯类物质，这些物质在烤后烟叶中未检出，推测烘烤过程中温度和水分的剧烈变化造成了这19种致香物质的转化或损失。在品种间表现为：南江3号有11种致香物质（苯乙醛等）含量极显著高于K326，己醛含量显著高于K326，但N-氧化-2，2'-联吡啶极显著低于K326。

2.1.2 烘烤前后共有的致香物质差异从表2可知，2个烤烟品种的致香物质含量在烘烤前后有显著变化，其中K326烟叶的6种致香物质含量（2-乙酰吡咯、苯甲醇、苯甲醛、苯乙醇、二氢猕猴桃内酯、新植二烯）在烘烤后呈极显著增加，4种类胡萝卜素降解产物含量（β-紫罗兰酮、芳樟醇、松油醇、香叶基丙酮）呈显著增加，而1，1'-二甲基-2，2'-联二吡咯、6-甲基-5-庚烯-2-酮和降茄二酮在烘烤后呈极显著下降，2，6-二甲基-2，6-辛二烯和壬醛呈显著下降。南江3号的β-紫罗兰酮、二氢猕猴桃内酯、香叶基丙酮、新植二烯和十一醛5种致香物质在烘烤后呈极显著增加，3种棕色化反应产物2-丁基噻吩、2-乙酰吡咯和六氢化-8a-甲基-1，8-（2H，5H）-萘二酮呈显著增加，而6-甲基-5-庚烯-2-酮、藏红花醛、降茄二酮、茄酮、2，6-二甲基-2，6-辛二烯呈极显著降低。总体来看，K326和南江3号烟叶中2-乙酰吡咯、苯乙醇、β-紫罗兰酮、二氢猕猴桃内酯、香叶基丙酮、十一醛和新植二烯含量在烘烤后呈极显著或显著增加，而6-甲基-5-庚烯-2-酮、降茄二酮和2，6-二甲基-2，6-辛二烯含量在烘烤后呈极显著或显著降低。

2.1.3 烘烤后独有致香物质仅在烘烤后烟叶中检测到的36种致香物质主要是类胡萝卜素降解产物、棕色化反应产物和其他类香气物质，这些物质在烘烤前烟叶中未检出，推测其均属于烘烤过程中产生的次生代谢产物。由表3可知，在品种间表现为：K326有31种香气物质含量不同程度的高于南江3号，其中β-二氢大马酮和巨豆三烯酮D含量极显著高于南江3号，其含量分别是南江3号的2.61倍和2.84倍，3-羟基-α-二氢大马酮、β-大马酮、巨豆三烯酮A、巨豆三烯酮B、巨豆三烯酮C和巨豆三烯酮E含量显著高于南江3号，其含量分别是南江3号的1.60倍、2.07倍、2.14倍、2.04倍、2.18倍和2.35倍。

表1 不同烤烟品种烘烤前独有致香物质含量 ng/gTable1 The aroma components only found intobacco leaves before curing

表2 不同烤烟品种烘烤前后共有致香物质含量 ng/gTable2 The common aroma components contents in two tobacco cultivars before and after curing

表3 烘烤后独有中性致香物质含量ng/gTable3 The aroma components only found in tobacco leaves after curing

2.2 烘烤前后中性致香物质比例差异

从表4可知，新植二烯含量最高，占致香物质总量的77.92%～85.79%，因此将其单独分析。2个品种4类香气物质在烘烤前后所占比例（除美拉德反应产物）变化趋势相同，其中西柏烷类降解产物和其他类香气物质总量所占比例下降，K326降幅分别为11.26%和31.39%；南江3号降幅分别为6.17%和76.70%；而苯丙氨酸降解产物和类胡萝卜素降解产物所占比例明显上升，K326升幅为522.57%和800.00%，南江3号升幅为59.79%和468.82%。

表4 烘烤前后中性致香物质比例差异 %Table4 The differences of proportion of the neutral aroma compounds in two flue-cured tobacco leaves before and after curing

3 讨论

在已有的关于烤烟香气物质研究中，大多数集中在生态条件、遗传因素、栽培措施、烘烤工艺等对香气物质的影响，而关于烘烤前后香气物质的转化研究较少。王岚等［7］采用同时蒸馏萃取结合GC-MS法研究了K326烟叶在烘烤过程中致香成分变化，发现鲜烟叶中的叶醇（3-己烯醇）、3-己烯醛、2-己烯、6-甲基-5-乙基-3-庚烯-2-酮、己醇和己醛在烤后烟中不再检出，苯丙氨酸降解产物（苯甲醇、苯甲醛、苯乙醇）、新植二烯以及一些类胡萝卜素类降解产物（二氢猕猴桃内酯、β-紫罗兰酮、芳樟醇、松油醇、香叶基丙酮）含量在烘烤后显著增加，在烤后烟检测到了一些新增的香气物质如糠醇、愈创木酚、氧代-α-紫罗兰醇，这些结果与本研究相同，但在鲜烟叶中检出的一些成分（如3-羟基-α-二氢大马酮、β-大马酮、β-二氢大马酮、巨豆三烯酮、异佛尔酮、糠醛）及在烘烤后损失的一些香气成分（如2-戊基呋喃、2，2二氢-2，2-甲基呋喃、苯并噻唑）在本试验鲜烟叶中均未被检测到，究其原因可能有两点，一是烟叶产地不同，不同产地因光照、温度等条件的不同影响类胡萝卜素的积累［17］，另外有研究也表明不同生态区烟叶的致香物质存在一定的差异［18］；二是测定方法不同，本试验采用顶空固相微萃取直接在60 ℃下顶空进样，无需溶剂处理，同时所用烟叶是冷冻干燥后的烟叶，在无水分无溶剂的条件下萃取能保证烟叶原有的风格特征［16，19］，而该研究是鲜烟叶在沸食盐水中蒸馏，可能产生一些副产物并造成烟叶内部挥发性香气成分损失或分解变化，该研究在鲜烟叶中检测到的2-戊基呋喃、2，2二氢-2，2-甲基呋喃、苯并噻唑等美拉德反应物质，可能是鲜烟叶在沸水中蒸馏时发生糖和氨基酸反应的非酶促氧化性褐变产生的，3-羟基-α-二氢大马酮、β-大马酮、β-二氢大马酮、巨豆三烯酮、异佛尔酮等物质可能是鲜烟叶蒸馏时类胡萝卜素物质的降解转化产生的，因为类胡萝卜素物质本身含有较多的共轭双键，对热、光、氧等因素比较敏感，容易降解和异构化，如β-胡萝卜素在脂氧合酶作用下可形成β-紫罗兰酮和二氢猕猴桃内酯等，叶黄素发生双键断裂可生成3-羟基-α-紫罗兰酮和氧化异佛尔酮，3-羟基-α-紫罗兰酮可进一步转化形成巨豆三烯酮［20］。

近年来，关于烟叶特色形成的物质代谢机理研究已逐渐成为烤烟研究热点之一。很多学者对不同香型生态区初烤烟叶香气物质进行了分析，如席元肖等［21］采用同时蒸馏萃取法结合GC-MS法对初烤烟叶（B2F和C3F）香气物质进行研究，发现中间香型烟叶β-紫罗兰酮、二氢猕猴桃内酯和芳樟醇含量显著低于清香型，巨豆三烯酮4种同分异构体的含量极显著低于浓香型。詹军等［22］也采用同时蒸馏萃取法结合GC-MS法分析比较了C3F烟叶中类胡萝卜素降解香气物质差异，结果表明，不同香型烤烟的类胡萝卜素降解形成的各种香气物质含量存在较大差异。前人的研究表明，初烤烟叶中类胡萝卜素降解产物与烟叶特色有一定的相关性。通过对不同香型烟叶转录谱和次生代谢物质研究发现，类胡萝卜素物质在鲜烟叶中含量与烟叶特色相关［23］。本试验发现烘烤过程中造成了54种致香物质的转化，其中包括类胡萝卜素物质降解产生了如巨豆三烯酮A、B、C、D、E、β-大马酮、β-二氢大马酮和β-紫罗兰醇等18种香气物质。综上，不同香型烟叶烘烤前类胡萝卜素物质累积不同，导致烘烤后降解产物含量不同。因此，研究烟叶烘烤前后物质变化，有利于研究烤后烟叶中重要化学物质如香气类物质等的前体物，为下一步研究这些物质在烤烟生长过程中的代谢基础以及调控提供依据。

本试验结果表明，在烘烤过程中发生了多种物质的转化，损失了醛、醇和酯类等19种香气物质，产生了类胡萝卜素降解产物、棕色化反应产物等36种香气物质。

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Difference of the Neutral Aroma Compounds in Flue-cured Tobacco before and after Curing

ZHAO Huina1， CAI Kai1， LEI Bo1*， WU Shengjiang1， REN Zhu1， XIANG Zhangmin1，PAN Wenjie1， YAO Shanshan2， CAI Bin1
（1.Guizhou Academy of Tobacco Science， Guiyang 550081， China；2. Qianjiang Tobacco Company of Chongqing， Chongqing 409000， China）

In order to study the effect of curing process on neutral aroma compounds of tobacco， HS-SPME-GC×GC-TOFMS and half leaf method were used to analyze kinds， contents and proportion of the neutral aroma compounds in two flue-cured tobacco cultivars （K326， Nanjiang 3） before and after curing. The results showed that there were significant changes in kinds， contents and proportion of the neutral aroma compounds. （1） Many kinds of aroma compounds were degraded or transformed during curing process， 19 aroma compounds uniquely found in tobacco leaves before curing and 36 extra aroma compounds found in tobacco leaves after curing； （2） By the end of curing， the total amount of aroma compounds were significantly higher than before curing， and the total amount of aroma compounds （except neophytadiene） in K326 was significantly higher than that Nanjiang 3 for witch transformed more fully；（3） The proportion of phenylalanine degradation products and carotenoids degradation products in the total amount of neutral aroma compounds increased significantly. Conversely， the proportion of cembratriendid compounds significantly decreasedafter curing. In conclusion， 36 kinds of extra aroma compounds （mainlymaillard reaction production and carotenoid degradation production） generated during cuing， but 19 kinds ofaromatic components （mainlyaldehydes，alcohols and esters） lost.

flue-cured tobacco； HS-SPME-GC×GC-TOFMS； curing； cultivar； neutral aroma compound

TS41+1

1007-5119（2015）02-0008-06

10.13496/j.issn.1007-5119.2015.02.002

国家烟草专卖局重大专项“中间香型特色优质烟叶开发物质代谢基础研究”（TS-02-20110014）；贵州省烟草公司项目（201315）

赵会纳，女，硕士，助理研究员，从事烟草栽培生理和物质代谢研究。E-mail： zhaohn1983@163.com。*通信作者，E-mail： leibo_1981@163.com

2014-07-03

2014-09-20