有氧运动对自发性高血压大鼠动脉平滑肌RhoA/Rho激酶活性的影响

唐光旭 张寒梦 袁献双 石丽君

1 河西学院体育学院（甘肃张掖734000）

2 北京体育大学运动生理教研室

血管平滑肌的收缩状态决定血管腔的大小， 血管平滑肌紧张度异常增大参与了血管疾病的发生机制。更好地理解调节血管紧张度的分子机制对于预防和治疗血管疾病至关重要。 高血压最重要的发病机制即血管阻力增加，但是其分子机制还未完全阐明。 Ras同源基因家族成员A （Ras homolog gene family member A，RhoA） 是小G蛋白超家族中Rho家族的Rho亚族中的一个成员， 它含有所有小GTP结合蛋白中高度保守的GDP／GTP结合区和GTP酶活性区， 此外还具有靶区和膜定位结构[1]。 静息状态时，RhoA与GDP结合存在于胞质中，RhoA被激活后向具有活性的RhoA-GTP转变，同时转位至细胞膜。 当恢复静息状态时，RhoA从胞膜转移至胞质内。被激活的RhoA-GTP在下游激活其靶目标Rho激酶（ROCK），后者与蛋白轻链磷酸酶（myosin light chain phosphase，MLCP）的MYPT1亚基结合，使其T850和T696位点发生磷酸化而失活， 导致肌球蛋白轻链（myosin light chain，MLC）的磷酸化水平升高，进而增强平滑肌的收缩[2]。 RhoA/Rho激酶信号通路可以通过对血管平滑肌细胞（VSMC）的各种作用介导血管紧张度的改变，调节血管阻力，甚至参与高血压的发生和发展[3]。

Rho激酶参与高血压的发生与发展首次被Uehata等[4]间接提出，他们在实验中观察到Rho激酶特异性抑制剂Y-27632可显著降低高血压模型大鼠血压。 另外，于自发性高血压大鼠 （Spontaneously hypertensive rat，SHR） 孤束核使用Rho激酶抑制剂或显性失活Rho突变体，可导致其心率和血压持续下降，而在正常血压大鼠却未见明显变化，也提示Rho激酶参与了高血压外周及交感神经系统的发病机制[5-7]。其它系列研究表明，法舒地尔（fasudil，Rho激酶抑制剂）可显著抑制冠状血管病变并通过减少内皮超氧阴离子的产生而改善内皮舒张功能，从而抑制高血压模型中的心脏肥厚，也提示Rho激酶很大程度上参与了高血压性血管疾病和高血压性心脏肥厚的发生[8，9]。近年研究发现，RhoA/ROCK通路与其它多种参与调节血管功能的信号通路都存在相互作用，如eNOS、AngⅡ、NADPH氧化酶、细胞外基质等。 研究证实NO可负性调节RhoA/ROCK通路[10]，而AngⅡ可正性调节此通路[11]。 运动对机体中多种内源性物质均有调节作用，如运动可下调动脉AngⅡ含量以及增加其NO含量， 从而降低血压， 提示运动与高血压的RhoA/Rho激酶信号通路可能存在联系。 然而查阅文献，有关运动对高血压动脉收缩特性以及血管平滑肌细胞中RhoA蛋白表达的影响鲜有报道。 本研究以RhoA/Rho激酶信号通路的Rho和Rho激酶为着眼点， 应用离体微血管环张力测定以及Pull down技术，通过8周有氧运动训练， 初步探讨有氧运动对高血压动脉功能改善中的RhoA/Rho激酶信号转导机制， 为阐明高血压发病机制及运动疗法的作用机理提供实验依据。 对该通路的深入研究，不仅对高血压病，同时也可为其他多种疾病的防治提供新策略。

1 对象与方法

1.1 实验对象和分组

原发性高血压模型选用12周龄、 健康雄性自发性高血压大鼠（SHR）12只，随机分为高血压安静对照组（SHR-SED，n = 6）和高血压有氧运动组（SHR-EX，n =6）。 同时选用同龄雄性WKY（Wistar-Kyoto）大鼠6只作为正常血压对照组（WKY），由北京维通利华实验动物中心提供。 动物生产许可证批号SCXK（京）2012-0001，动物使用许可证批号SYXK（京）2011-0034，动物批号（11400700028798），于北京体育大学实验动物房饲养。高血压有氧运动组（SHR-EX）大鼠进行跑台运动训练，运动方案是适应性训练1周（10 m/min，15 min/day）后，进行8周跑台运动，坡度0°，20 m/min（约55%～65%VO2max），5d/wk，60 min/day[12，13]。 高血压安静对照组（SHR-SED）和正常血压对照组（WKY）不运动，自由进食饮水。

1.2 无创血压和心率测定

各组大鼠分别于训练前（第12周）及训练后（第21周）进行尾动脉血压及心率监测，仪器采用智能无创血压计BP-2010A（北京软隆生物技术有限公司）。

1.3 大鼠肠系膜动脉收缩特性检测

在最后一次训练结束后的24～48h内， 将大鼠腹腔麻醉（戊巴比妥，50 mg/kg）后断头处死，迅速打开腹腔取肠系膜动脉（2 min内完成），用于下述两部分实验，一部分用于血管环收缩张力检测， 另一部分立即投入液氮中暂存，之后转入-80℃冰箱保存，用于RhoA-GTP蛋白表达检测。 用于血管环收缩张力检测的组织先放入4℃Na-Hepes缓冲液中， 在体视显微镜下剥离肠系膜上的脂肪组织，剪取约1.5 mm长的二级动脉环。 血管环用两根1.5 cm左右的钨丝固定在DMT浴槽中，一端固定在微调标尺上，以调节微血管静息张力，另一端与张力换能器相连浸入pH值为7.4、37℃的Na-Hepes缓冲液中，并向浴液内通以95%O2－5%CO2，平衡10 min，使血管基础张力维持在1 mN左右。 以120 mM的KCl刺激血管收缩，冲洗血管3次，待张力稳定后加入40 mM的LNAME，孵育10 min。 为检测RhoA/Rho激酶信号通路在各组之间的功能差异，我们先给予血管环NE（10-5M）诱发血管收缩， 在达到平台后， 以浓度递增方式加入Rho激酶抑制剂Y-27632（3×10-8－10-5M），观察血管环反应特性。

1.4 大鼠肠系膜动脉RhoA-GTP蛋白表达检测

1.4.1 组织蛋白抽提

从-80℃冰箱中取出肠系膜动脉组织，放入研钵中液氮研磨粉碎。 称取约100 mg组织粉末，放入1.5 ml的离心管中，迅速加入500 μl RIPA裂解液，用匀浆器在冰水浴中匀浆10次左右。将匀浆液于4℃以13，400×g 离心30 min，取上清液，使用BCA试剂盒检测蛋白浓度，调整蛋白的终浓度为0.5 mg/ml。

1.4.2 蛋白质纯化及Pull down

取30 μg蛋白样品进行RhoA总蛋白表达的检测；各取250 μg蛋白分别作为阳性对照与阴性对照样品制备。 阳性对照：取250 μg蛋白加入1/100体积的GTPγS，室温混匀孵育15 min后，加入stop buffer（1/10体积），并放置于4℃终止反应。 阴性对照中除加入1/100体积的GDP外，其余操作同阳性对照的制备。 向250 μg待测蛋白样品、阴性、阳性对照样品中分别加入25 μl rhotekin-RBD beads，4℃摇床混匀孵育1 h。 4℃4000×g离心1 min，弃上清。预冷wash buffer 洗涤beads 1次。加入15 μl 2×laemmli sample buffer，沸水煮2min。 4000×g离心取上清进行SDS-PAGE。 上样电泳，转膜，封闭，使用1∶500一抗以及1∶10000山羊抗鼠二抗孵育，曝光显影。

1.5 统计学分析

所有结果均以Mean ± SEM表示， 应用SPSS19.0、GraphPad Prism5进行统计分析， 采用单因素方差分析（ANOVA）以及独立样本t检验，P ＜0.05为有显著性差异。

2 结果

2.1 有氧运动对SHR基础血压和心率的影响

无创尾动脉血压测试显示，SHR-SED组大鼠收缩压（SBP，193.8 ± 5.8 mmHg）显著高于WKY组（129.4 ±5.6 mmHg，P < 0.05），而SHR-EX组大鼠SBP（150.8 ±6.8 mmHg）显著低于SHR-SED组（P < 0.05），但仍高于WKY组 （P < 0.05）（图1A）。 SHR-SED组心率（heart rate，428 ± 15 bpm）显著高于WKY组（388 ± 12 bpm），SHR-EX组（394 ± 11 bpm） 显著低于SHR-SED组，与WKY组比较无显著差异（图1B）。 这提示有氧运动能有效缓解高血压，但不能使其降低至正常水平；有氧运动可削弱高血压大鼠安静心率的升高。

2.2 有氧运动对SHR肠系膜动脉收缩特性的影响

2.2.1 有氧运动对KCl和NE诱发的肠系膜动脉收缩反应的影响

无论是正常血压组还是高血压组，120 mM KCl和NE（10-5M）均可诱发肠系膜动脉收缩反应，各组间120 mM KCl诱发的最大收缩张力 （Kmax） 无显著性差异。NE（10-5M）诱发的收缩张力标准化为%Kmax，可以发现在SHR-SED组最大 （134.3 ± 5.2 %Kmax）， 其次为SHR-EX组 （113.5 ± 3.8%Kmax）， 最小的为WKY组（105.8 ± 3.5 % Kmax）。

图1 各组基础血压和心率比较

2.2.2 有氧运动对Rho激酶抑制剂Y-27632诱发的肠系膜动脉舒张反应的影响

如图2所示，Y-27632可诱发肠系膜动脉呈浓度依赖性舒张。pD2为药物半量最大反应的平均有效浓度的负对数，主要反映血管对药物的敏感性。 引起50%最大舒张反应Y-27632 的浓度的负对数 （pD2） 分别是WKY：4.86 ± 0.16；SHR-SED：5.76 ± 0.05；SHR-EX：5.06 ± 0.15（各组n = 6），提示高血压大鼠肠系膜动脉对Y-27632的敏感性增强，8周有氧运动可减弱高血压大鼠肠系膜动脉对Y-27632的敏感性。

图2 有氧运动对Y-27632诱发肠系膜上动脉舒张的剂量-反应曲线

2.3 有氧运动对SHR肠系膜动脉RhoA-GTP蛋白表达的影响

如图3A所示，本实验采用亲和层析纯化方法，得到了纯度较高的复合物RhoA-GTP以及Total-RhoA蛋白，并且3组Total-RhoA含量无明显差异。 与内参β-actin相比，将WKY组作为1.00 ± 0.00，其SHR-SED和SHR-EX组的Total-RhoA含量分别为（1.02 ± 0.01，1.01 ± 0.01，各组n = 6）。 如图3B所示，3组pulldown实验所得到的蛋白复合物RhoA-GTP相对含量有差异。 与WKY组相比，SHR-SED组和SHR-EX组肠系膜动脉RhoA-GTP相对含量显著增加 （P < 0.05）； 与SHR-SED组相比，SHREX组RhoA-GTP相对含量显著减少（P > 0.05）。

图3 各组大鼠肠系膜动脉RhoA-GTP蛋白表达比较

3 讨论

长期运动会导致动脉结构和功能发生改变， 主动脉和大动脉血管顺应性变大，血管外周阻力减小[14]。 肠系膜动脉为阻力血管，在全身的动脉中占的比例最大，是形成全身外周阻力的主要血管[15]。 它的收缩和舒张可显著影响胃肠等器官的血流量， 对正常血压的维持及维持其它重要器官血液供应发挥着不可替代的作用。研究表明，有氧运动改善衰老大鼠心血管反应性以及肠系膜动脉舒缩功能[16]。 本实验结果显示，经过8周有氧运动，高血压大鼠收缩压明显下降，在实验中我们使用去甲肾上腺素（NE）诱发肠系膜动脉收缩反应，NE通过与肾上腺素能受体结合， 可以对血管产生强烈的收缩作用。 本实验中有氧运动可有效减弱高血压大鼠肠系膜动脉对NE的敏感性，但运动组仍显著高于正常血压对照组， 表明高血压大鼠的血管对加压物质的敏感性较正常大鼠增强。 由此说明有氧运动可以作为辅助手段来控制血压。

血管阻力增加是高血压最重要的发病机制。 研究证明，RhoA/Rho激酶信号通路可以引起VSMC紧张度的改变，调节血管阻力[17]，因此，它与高血压的发生和发展有着密切联系。近年有研究表明，在多种高血压动物模型中， 包括幼年尚未出现血压升高的SHR中，RhoA/Rho激酶信号通路的活性都被证实有所增强，这一现象是通过抑制MLCP活性， 引起MLC磷酸化水平升高，造成血管平滑肌细胞的过度反应产生的。 长期给予非低血压剂量的Rho激酶特异性抑制剂法舒地尔（fasudil）可以明显抑制SHR冠状血管病变形成，充分说明Rho激酶参与了高血压血管疾病的发生机制。 同样，Rho激酶特异性抑制剂Y-27632可以阻断Rho激酶的活性，减弱血管收缩，下调内皮型一氧化氮合成酶（eNOS）[18]，它被广泛应用于RhoA/Rho激酶信号通路的研究中。 有研究证实Y-27632的使用降低了多种系统性高血压大鼠模型的全身血压[19]。 对比而言，同等剂量的Y-27632对正常血压的动物并没有显著影响。 本实验采用离体肠系膜动脉微血管环， 并选用Y-27632来探讨其中可能的机制，结果显示，Y-27632（3×10-8～10-5M）可诱导肠系膜动脉二级分支呈浓度依赖性舒张反应， 由此说明RhoA/Rho激酶信号通路很大程度上参与了高血压的发病机制。

如今， 通过运动预防和治疗高血压已经得到重视并大量研究，高血压病是一种多因素变化的疾病，发病机制复杂，治疗方法也有多种，运动干预作为不可或缺的一种，不仅缓解了高血压病的高压状态，还避免了降压药物的副作用，增进机体的整体健康水平。运动对血管功能的调控目前日益受到人们的关注， 但大部分都集中在血管内皮功能改善方面。以往研究表明，有氧运动可以促进血管内皮细胞分泌血管舒张物质NO，增强内皮依赖性舒张，以此来调节血管张力[20]。 而有氧运动对VSMC结构和功能有哪些影响，目前还不清楚。 本实验中高血压运动组大鼠血管对Y27632的敏感性（pD2）大于正常血压组， 但小于高血压安静组。 由此可以推断，高血压时血管对Y-27632的敏感性增强，有氧运动可以降低血管对Y-27632的敏感性。 因此，RhoA/Rho激酶在有氧运动促进VSMC功能重塑过程中起着非常重要的作用。本研究发现，高血压安静组大鼠肠系膜动脉RhoA-GTP的相对含量明显高于正常血压组大鼠，而高血压运动组的相对含量较安静组略有降低。 这提示RhoA参与了高血压的发展进程，高血压时RhoA/Rho激酶信号通路功能的增强可能与其RhoA的活化量增加有关，8周规律的有氧运动可以防止更多的RhoA被激活，来抑制RhoA/Rho激酶信号通路的活性，最终达到运动降压的目的。

RhoA/Rho激酶信号通路在高血压等心血管疾病的发生发展进程中通过调节平滑肌收缩， 抑制血管细胞的分化、 增殖、 迁移及分泌等许多方面影响血压。 在VSMC内的RhoA蛋白，被上游的信号分子激活，向下游的ROCK发出活化信号——花生四烯酸，Rho激酶自身发生多个氨基酸位点的磷酸化而激活，激活的ROCK对MLCP的MBS的697位Thr进行磷酸化修饰， 使MLCP失活， 失活的MLCP不能将MLC脱磷酸化， 于是胞浆内MLC磷酸化水平上升，促进肌动蛋白微丝骨架的聚合，最终导致VSMC收缩。 Rho蛋白参与调节细胞的多种生命过程，是细胞结构和功能发挥的重要分子[21]。 活化的RhoA形式是与GTP结合的RhoA-GTP，RhoA活化诱导了下游重要的效应器如Rho激酶后，影响细胞的骨架重组和基因的转录翻译[22]。 Otto等[23]利用去膜的平滑肌研究发现， 加入RhoA的显性激活突变体Val14RhoA能显著增强氯化乙酰胆碱诱导的平滑肌收缩的钙敏化，而且这种效应能被C3抑制，说明RhoA参与了平滑肌收缩的钙敏化机制。 目前已证实RhoA是收缩蛋白钙敏化的主要调节物[24]。 同时，实验证明，RhoA表达量或活性的改变与平滑肌细胞表型转化密切相关， 在收缩型平滑肌细胞，RhoA的表达及活性均增强， 而合成型RhoA的表达则维持在较低水平[25]；RhoA还通过影响AngⅡ等血管活性物质影响交感神经活性，通过中枢调节血压。

4 总结

有氧运动可减弱高血压所致的RhoA/Rho激酶信号通路RhoA-GTP上调，这可能是有氧运动改善肠系膜动脉舒缩功能的重要机制之一。

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