洪玉锋,张 熊
(1.陕西中医药大学第二附属医院妇二科,陕西 咸阳 712000;2.咸阳市第一人民医院检验科,陕西 咸阳 712000)
Ezrin和p16基因在宫颈癌和宫颈柱状上皮异位组织中的表达及其临床意义
洪玉锋1,张 熊2
(1.陕西中医药大学第二附属医院妇二科,陕西 咸阳 712000;2.咸阳市第一人民医院检验科,陕西 咸阳 712000)
目的探讨埃兹蛋白(Ezrin)和p16基因在宫颈癌和宫颈柱状上皮异位组织中的表达及其临床意义。方法采用实时逆转录-聚合酶链反应(RT-PCR)技术检测39例宫颈癌患者和35例宫颈柱状上皮异位患者组织Ezrin mRNA和p16 mRNA的表达,并选取正常宫颈组织作为对照组,比较分析以上指标的变化。结果Ezrin mRNA和p16 mRNA在宫颈癌组、宫颈柱状上皮异位组及对照组中的表达率分别为89.7%、22.8%、21.0%和94.8%、22.8%、5.2%。Ezrin mRNA在宫颈癌组织中的表达率显著高于宫颈柱状上皮异位组及对照组(P<0.01),在宫颈柱状上皮异位与对照组中Ezrin mRNA表达率比较差异无统计学意义(P>0.05)。p16 mRNA在宫颈癌与宫颈柱状上皮异位组织中的表达率显著高于对照组(P<0.01),在宫颈癌组织的表达率高于宫颈柱状上皮异位组织,差异均有显著统计学意义(P<0.01)。Ezrin mRNA和p16 mRNA分别在宫颈癌组、宫颈柱状上皮异位组及对照组中的表达量分别为(0.82±0.17)、(0.25±0.06)、(0.23±0.07)和(0.77±0.12)、(0.35±0.07)、(0.22±0.05)。Ezrin mRNA和p16 mRNA在宫颈癌组中的表达量具有相关性(r=0.539,P<0.01)。结论检测组织Ezrin和p16基因表达可应用于宫颈癌和宫颈柱状上皮异位的鉴别诊断,并为宫颈癌的早期发现提供依据。
埃兹蛋白;基因p16;宫颈癌;宫颈柱状上皮异位
宫颈癌是最常见的妇科恶性肿瘤,宫颈癌和癌前病变的早期发现及治疗,可降低该病的发病率和死亡率。宫颈柱状上皮异位过去称为宫颈糜烂,早期宫颈癌常无明显症状和体征,宫颈可光滑,难以与宫颈柱状上皮异位区别,容易造成漏诊或误诊[1]。有研究认为,埃兹蛋白(Ezrin)和p16基因在多种肿瘤组织中存在过度表达[2-3],近年来出现了Ezrin和p16基因与宫颈癌相关的报道[4-5],Ezrin在宫颈柱状上皮异位组织中少见报道。本研究通过实时逆转录-聚合酶链反应(RT-PCR)技术分析宫颈癌和宫颈柱状上皮异位患者组织Ezrin与p16基因的表达,探讨两种标志物与相关病理因素间的关系,旨在为上述两种疾病的鉴别诊断提供新的途径。
1.1 一般资料 收集2012年1月至2014年10月在陕西中医药大学第二附属医院经病理确诊的宫颈病变组织标本共112例,分成三组,其中宫颈癌组39例,宫颈柱状上皮异位组35例,正常宫颈组织(对照组)38例。宫颈癌组年龄27~63岁,平均43.7岁;按照2009年国际妇产科联盟(FIGO)标准分期,其中IB1期12例,IB2期7例,ⅡA期11例,ⅡB期9例;高中分化25例,低分化14例;无盆腔淋巴结转移27例,有盆腔淋巴结转移12例;高危型HPV16/18阴性6例,阳性32例,1例遗漏未做。宫颈柱状上皮异位组年龄18~53岁,平均35.1岁,其中单纯型11例,颗粒型11例,乳突型13例;该组患者就诊时均有性生活史(未婚或已婚),近期未接受其他有关治疗,阴道清洁度为Ⅰ~Ⅱ度。对照组年龄20~59岁,平均40.7岁。本研究经本院伦理委员会批准,所有研究标本的收集均获得患者知情同意,所有标本均经病理医师再次阅片复诊。
1.2 检测方法
1.2.1 方法、仪器和试剂 采用实时逆转录-聚合酶链反应(RT-PCR)技术研究宫颈癌和宫颈柱状上皮异位患者组织Ezrin mRNA与p16 mRNA表达状况。RNA提取采用美国Invitrogen公司产品。lightCycler荧光PCR仪使用德国Roche公司产品。PCR试剂盒采用上海久盛医疗用品有限公司产品。
1.2.2 总RNA的提取 采用Trizol法提取组织中的总RNA,在分光光度计上检测A260/280的比值以验证RNA的纯度。
1.2.3 PCR扩增 用Primer5软件设计引物,Ezrin mRNA的引物序列为:正义链5'-GATGATGCGCGAGAAGGAGGAGTT-3',反义链5'-GGGGCGGGG GTGCTGTCAT-3';产物长度700 bp。p16的引物序列为:正义链5'-AGCCTTCGGCTGACTCGCTGGTCA-3',反义链5'-CTGCCCATCATGACCTGGCCTAAG-3',产物长度650 bp。β-actin作为内参照,引物序列为:正义链5'-ATGTCACGCACGATTTCC-3',反义链5'-CTGTCCCTGTATGCCTCTG-3',产物长度350 bp。反应条件:94℃3min→94℃60 s,58℃60 s,72℃1.5min,40个循环→72℃15min→4℃保存。
1.2.4 基因片段序列测定和分析 使用测序仪对PCR产物进行序列测定。将测序结果通过BLAST应用软件与GenBank中的已知序列进行同源性比较。
1.2.5 标志物相对表达量计算 对扩增的目的片段进行凝胶电泳,通过紫外光凝胶成像系统进行扫描并记录,用四维成像处理系统,测定各组的cDNA的特异性,miRNA表达量用Ct值的变化(△Ct)表示。△Ct=宫颈癌组或宫颈柱状上皮异位组Ct均值-对照组Ct均值。由2-△ct得出相应的miRNA的相对表达量。组织Ezrin mRNA和p16 mRNA电泳图见图1、图2。
图1 不同病变组织p16 mRNA表达
图2 不同病变组织Ezrin mRNA表达
1.3 统计学方法 应用SPSS18.0统计软件进行数据分析。计数资料比较采用χ2检验,计量资料以均数±标准差(±s)表示,采用t检验,相关性分析采用Pearson法,采用受试者工作特征曲线(ROC曲线)评价组织Ezrin mRNA和p16 mRNA在诊断宫颈癌和宫颈柱状上皮异位疾病中的作用,以P<0.05为差异有统计学意义。
2.1 三组受试者组织Ezrin mRNA和p16 mRNA表达率比较 Ezrin mRNA在宫颈癌组、宫颈柱状上皮异位组及对照组中的表达率分别为35/39(89.7%)、8/35(22.8%)、8/38(21.0%);p16 mRNA在上述三组中的表达率分别为37/39(94.8%)、8/35(22.8%)、2/38 (5.2%)。Ezrin mRNA在宫颈癌组织中的表达率明显高于其他两组(χ2=33.90、36.82,P<0.01),在宫颈柱状上皮异位与对照组中Ezrin mRNA表达率比较无统计学意义(χ2=0.035,P>0.05)。p16 mRNA在宫颈癌与宫颈柱状上皮异位组织中的表达率显著高于对照组(χ2=61.80、4.77,P<0.01、P<0.05),在宫颈癌组织的表达率高于宫颈柱状上皮异位组织,差异有统计学意义(χ2=40.17,P<0.01)。
2.2 三组受试者组织Ezrin mRNA和p16 mRNA表达量比较 Ezrin mRNA在宫颈癌组、宫颈柱状上皮异位组及对照组中的表达量分别为(0.82±0.17)、(0.25±0.06)、(0.23±0.07);p16 mRNA在上述三组中的表达量分别为(0.77±0.12)、(0.35±0.07)、(0.22±0.05)。Ezrin mRNA在宫颈癌组织中的表达量明显高于其他两组(t=41.18、42.60,P<0.01),宫颈柱状上皮异位与对照组中的表达量比较差异无统计学意义(t=1.58,P>0.05)。p16 mRNA在宫颈癌与宫颈柱状上皮异位组织中的表达量显著高于对照组(t=46.75、21.87,P<0.01),宫颈癌组织中的表达量高于宫颈柱状上皮异位组织,差异有统计学意义(t=33.28,P<0.01)。
2.3 Ezrin mRNA和p16 mRNA表达量的相关性 Ezrin mRNA和p16 mRNA在宫颈癌组中的表达量具有正相关性(r=0.539,P<0.01)。
2.4 ROC曲线分析 宫颈癌组以宫颈柱状上皮异位组为参照,Ezrin mRNA和p16 mRNA表达量的AUC分别为0.719、0.682(P<0.01),联合检测Ezrin mRNA和p16 mRNA的AUC为0.853(P<0.01),单独检测组织Ezrin mRNA和p16 mRNA表达量分别用于诊断宫颈柱状上皮异位时,以对照组为参照的AUC分别为 0.307,P>0.05;0.607,P<0.01。组织Ezrin mRNA和p16 mRNAROC曲线见图3~图5。
图3 联合检测两标志物ROC曲线;
图4 宫颈癌组单独检测两标志物ROC曲线;
图5 宫颈柱状上皮异位组单独检测两标志物ROC曲线
近年来研究认为Ezrin在多种肿瘤组织中过度表达,在妇科肿瘤、胰腺癌、乳腺癌中,其高表达均已被证实与肿瘤转移有关[2]。Ezrin蛋白与肿瘤细胞表面直接接触后作用于其表面的粘附因子,进一步影响肿瘤的分化、侵袭性和转移[6]。有研究发现Ezrin、IL-6和MMP-9在子宫颈浸润性鳞癌中的过度表达与子宫颈鳞癌的侵袭行为有关,其可作为判断子宫颈鳞癌的早期诊断指标[7]。本研究显示,Ezrin在宫颈癌组织中表达高于宫颈柱状上皮异位组织及正常宫颈组织(P<0.01),在宫颈柱状上皮异位组织与及正常宫颈组织中表达差异无统计学意义(P>0.05),提示Ezrin蛋白与宫颈癌的发生、发展相关,其可作为鉴别宫颈癌和宫颈柱状上皮异位的一项重要的标志物。
p16基因是一种抑癌基因,其与多种恶性肿瘤的发生和发展有关系,因此也被称为肿瘤抑制基因。但在宫颈癌组织中p16基因呈现过度表达[3],其与肿瘤的侵袭性及淋巴转移有关[8-9],可作为检测宫颈癌及其癌前病变的一个有效的标志物[10]。本研究显示,p16基因在宫颈癌组织和宫颈柱状上皮异位组织中表达高于正常宫颈组织(P<0.01),在宫颈癌组织的表达又高于宫颈柱状上皮异位组织(P<0.01)。推测p16基因在宫颈癌的发生和发展中起到非常重要的作用,可以作为鉴别宫颈癌前病变和宫颈柱状上皮异位的分子标记物。
Ezrin mRNA和p16 mRNA在宫颈癌组中的表达量具有正相关性,显示两标志物与宫颈癌的病变发展密切相关。利用ROC曲线评价两标志物的结果显示,组织Ezrin和p16基因在鉴别宫颈癌与宫颈柱状上皮异位疾病中有诊断意义(P<0.01)。单独检测组织p16基因对诊断宫颈柱状上皮异位有意义(P<0.01),而单独检测Ezrin对宫颈柱状上皮异位无独立的诊断意义(P>0.05)。
综上所述,组织Ezrin和p16基因的检测可应用于宫颈癌和宫颈柱状上皮异位的鉴别诊断,并为宫颈癌的早期发现提供依据。
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Expression and clinical significance of Ezrin and p16 in tissues of cervical cancer and cervical columnar epithelium ectopy.
HONG Yu-feng1,ZHANG Xiong2.1.The Second Departerment of Gynaecology,the Second Affiliated Hospital of Shaanxi University of Chinese Medicine,Xianyang 712000,Shaanxi,CHINA;2.Department of Clinical Laboratory,the First People's Hospital of Xianyang City,Xianyang 712000,Shaanxi,CHINA
ObjectiveTo explore the expression and clinical significance of Ezrin and p16 in tissues for cervical cancer and cervical columnar epithelium ectopy.MethodsThe expression of Ezrin mRNA and p16 mRNA were detected with the polymerase reaction technology in the tissues of 39 patients with cervical cancer(group A)and 35 patients with cervical columnar epithelium ectopy(group B).Normal cervical tissues were selected as the control group.The changes of above indicators were compared.ResultsThe expression rates of Ezrin mRNA and p16 mRNA in group A,group B and the control group were 89.7%,22.8%,21.0%and 94.8%,22.8%,5.2%,respectively. The expression rates of Ezrin mRNA in group A was significantly higher than the other two groups(P<0.01),which showed no statistsically significantly differnece between group B and the control group(P>0.05).The expression rates of p16 mRNA in group A and group B were signifiantly higher than that in the control group(P<0.01),and that in group A was higher than that in group B(P<0.01).The expression quantities of Ezrin mRNA and p16 mRNA in group A,group B, the control group were(0.82±0.17),(0.25±0.06),(0.23±0.07)and(0.77±0.12),(0.35±0.07),(0.22±0.05),respectively.Expression of Ezrin mRNA and p16 mRNA were corelated in group A(r=0.539,P<0.01).ConclusionTesting the expression of Ezrin and p16 in tissues can be used in the differential diagnosis between cervical cancer and cervical columnar epithelium ectopy,which provides basis for the early discovery of cervical cancer.
Ezrin;p16;Cervical cancer;Cervical columnar epithelium ectopy
R737.33
A
1003—6350(2015)21—3127—04
2015-03-12)
10.3969/j.issn.1003-6350.2015.21.1138
张 熊。E-mail:418079040@qq.com