AIF-1及IL-1β在溃疡性结肠炎小鼠体内表达的研究

刘 翔，曾柳苑，林 虹

（广州医科大学附属第二医院消化内科，广东 广州 510260)

AIF-1及IL-1β在溃疡性结肠炎小鼠体内表达的研究

刘 翔，曾柳苑，林 虹

（广州医科大学附属第二医院消化内科，广东 广州 510260)

目的探讨同种异体移植物炎症因子-1(AIF-1)及白细胞介素-1β(IL-1β）在溃疡性结肠炎致病机制中的作用。方法90只BALB/c小鼠随机分为三组，每组30只，第1组用葡聚糖硫酸钠(DSS)造模为溃疡性结肠炎，第2组用大肠杆菌造模为细菌性肠炎，第3组为正常对照，取得各组小鼠的外周血及结肠标本，用ELISA的方法检测AIF-1、IL-1β的表达，比较其在三组小鼠体内表达的差异。结果(1)溃疡性结肠炎小鼠AIF-1表达水平分别为外周血中(0.134±0.048)ng/ml，结肠中(0.462±0.117)ng/ml，均较细菌性肠炎[外周血中(1.425±0.229)ng/ml、结肠中(1.261±0.48)]ng/ml高，各组间比较差异均有统计学意义(P＜0.05)；(2)溃疡性结肠炎小鼠IL-1β表达分别为外周血中(0.894±0.173)ng/ml，结肠中(1.261±0.048)ng/ml，与细菌性肠炎[外周血中(0.087±0.021)ng/ml、结肠中(0.149±0.057)ng/ml]比较差异均无统计学意义(P＞0.05)；(3)溃疡性结肠炎及细菌性肠炎小鼠AIF-1与IL-1β表达水平无相关性(P＞0.05)。结论AIF-1可能参与了溃疡性结肠炎的特异性致病机制，IL-1β可能未参与特异性致病机制。

同种异体移植物炎症因子-1；白细胞介素-1β；溃疡性结肠炎；致病机制

溃疡性结肠炎(Ulcerative colitis，UC)是当今胃肠病学研究中的热点，其发病机制至今尚无定论。已有的结果显示遗传背景、结肠内微生态、宿主免疫因素均参与了溃疡性结肠炎的发病，其中免疫因素在溃疡性结肠炎的发病中占据的地位越来越受到人们的重视，甚至有较为前沿的观点认为溃疡性结肠炎与自身免疫有着密切联系[1-2]。同种异体移植物炎症因子-1 (Allograft inflammatory factor-1)是新近发现的和机体免疫有关的炎症因子，已有动物试验证实其参与了小鼠实验性结肠炎的病理过程，但其是否参与了溃疡性结肠炎的发病目前尚无相关研究，有必要对此进行探索。

1 材料与方法

1.1 实验材料

1.1.1 动物 90只SPF级BALB/c小鼠，雌雄各半，8～10周龄，体重(25±5)g，来源于广东省实验动物中心。

1.1.2 材料和仪器 葡聚糖硫酸钠(Dextran sulphate sodium，DSS)购于Sigma公司，大肠杆菌菌株购自武汉典型培养物保藏中心。ELISA试剂盒：IL-1β(Interleukin-1β，白细胞介素-1β)(深圳晶美公司，批号：2014153)，AIF-1(深圳晶美公司，批号：2014187)。

1.2 方法

1.2.1 试验动物分组及处理 90只小鼠，随机分为三组，每组30只，第1组予5%DSS溶液自由饮用造模为溃疡性结肠炎，第2组予大肠杆菌菌液灌胃造模为细菌性肠炎，第3组正常对照组。小鼠均于实验第12天时处死，眼球取血、无菌解剖取结肠组织用于分子生物学检测。

1.2.2 AIF-1、IL-1β表达水平的测定 采用试剂盒推荐的双抗体夹心ELISA法。处理好血和结肠组织样本后，将预包被好的抗AIF-1或IL-1β单抗酶标板上分别加入标准品和待测样品，结合后加入抗AIF-1或IL-1β抗体，形成免疫复合物后再加入辣根过氧化物酶标记的Steptavidin，最后加入酶底物显色，492 nm波长处测吸光度值，通过标准曲线求出待测样品中的AIF-1或IL-1β浓度。

1.3 统计学方法 应用SPSS18.0软件进行统计分析，检验所有数据正态性，计量资料以均数±标准差(±s)表示，比较前检验方差齐性(以α=0.1为检验水准，P＞0.1则方差齐)，各组方差齐时用LSD法进行均数比较，各组方差不齐时用Dunnett T3进行均数比较。相关性分析用Pearson法，以P＜0.05为差异有统计学意义。

2 结 果

2.1 各组小鼠外周血和结肠组织中AIF-1的表达 溃疡性结肠炎小鼠外周血中AIF-1的表达水平较细菌性肠炎小鼠为高(F=22.17，P＜0.05)，且二者均高于正常小鼠(P＜0.05)。溃疡性结肠炎小鼠结肠组织中AIF-1表达水平较细菌性肠炎小鼠高(F= 16.25，P＜0.05)，且二者均高于正常小鼠(P＜0.05)，见图1、表1。

图1 ELISA检测各组小鼠外周血和结肠组织中AIF-1(±s)

表1 各组小鼠外周血和结肠组织中AIF-1的表达(±s，ng/ml)

表1 各组小鼠外周血和结肠组织中AIF-1的表达(±s，ng/ml)

组别 外周血AIF-1结肠AIF-1溃疡性结肠炎组(n=30)细菌性肠炎组(n=30)正常对照组(n=30) 0.134±0.048ab0.087±0.021a0.017±0.004 0.462±0.117ab0.149±0.057a0.053±0.024

2.2 各组小鼠外周血和结肠组织中IL-1β的表达 溃疡性结肠炎小鼠外周血中IL-1β的表达水平与细菌性肠炎差异无统计学意义(F=13.91，P＞0.05)，且二者均高于正常小鼠(P＜0.05)。溃疡性结肠炎小鼠结肠组织中IL-1β表达水平与细菌性肠炎差异无统计学意义(F=8.14，P＞0.05)，且二者均高于正常小鼠(P＜0.05)，见图2、表2。

2.3 各组小鼠AIF-1与IL-1β表达的相关性 在溃疡性结肠炎小鼠中，外周血内AIF-1与IL-1β表达水平无相关性(r=0.14，P＞0.05)，结肠组织中AIF-1与IL-1β表达水平无相关性(r=0.19，P＞0.05)。在细菌性肠炎小鼠中，外周血内AIF-1与IL-1β表达水平无相关性(r=0.22，P＞0.05)，结肠组织中AIF-1与IL-1β表达水平无相关性(r=0.07，P＞0.05)。

图2 ELISA检测各组小鼠外周血和结肠组织中IL-1β

表2 各组小鼠外周血和结肠组织中IL-1β的表达(±s，ng/ml)

表2 各组小鼠外周血和结肠组织中IL-1β的表达(±s，ng/ml)

注：a与正常组比较，P＜0.05；b与细菌性肠炎组比较，P＞0.05。

组别溃疡性结肠炎组(n=30)细菌性肠炎组(n=30)正常对照组(n=30)外周血IL-1β0.894±0.173ab0.728±0.225a0.127±0.051结肠IL-1β1.261±0.48ab1.425±0.229a0.195±0.048

3 讨 论

流行病学研究显示，我国的溃疡性结肠炎发病率呈逐年增多的趋势，溃疡性结肠炎是一种发生于肠道的持续性炎症疾病，在青壮年中多发。溃疡性结肠炎具有发病机制复杂、无法进行预防、目前缺乏特效治疗手段、无法根除等特点，造成了较高的致病、致残率，不但给患者带来痛苦，而且对医疗资源及社会资源也是极大的消耗，因此，溃疡性结肠炎的发病机制便成为当前的研究热点，明确其机制有助于找出特异性的治疗靶点。

已有大量研究表明，免疫反应是溃疡性结肠炎致病机制的中心环节，溃疡性结肠炎发病后各种炎症因子如白介素、肿瘤坏死因子、趋化因子的活化构成了肠道内炎症反应维持的基础。也有部分研究认为溃疡性结肠炎类似于自身免疫性疾病，其炎症反应机制是基于自身抗体的存在[2]。因此，寻找自身免疫分子对溃疡性结肠炎发病机制的影响，便成为了一种可行的研究方向。AIF-1被证实是一种有着多种功能的重要炎症因子，其在器官移植后排异、肿瘤、微生物感染等疾病的发生中起着重要的调控作用[3]，更令人兴奋的是，许多自身免疫性疾病，包括类风湿性关节炎、实验性结肠炎[4]等都被发现有AIF-1参与的机制。考虑到溃疡性结肠炎存在着自身免疫方面的异常，且免疫因素对其发病产生着强大的影响，那AIF-1所调控的免疫反应是否也参与了溃疡性结肠炎的发病？

本研究发现，在溃疡性结肠炎的小鼠模型体内，其肠道组织和外周血内的AIF-1表达均较正常小鼠为高，同时IL-1β的表达也同步升高，差异有统计学意义，证实溃疡性结肠炎小鼠发病后其体内自身免疫反应已被激活，这与已有的研究是基本一致的[5-6]。而在普通的细菌性肠炎小鼠模型体内，其肠道组织和外周血内的AIF-1、IL-1β亦有同步升高，这就证实了AIF-1能够参与炎症反应的观点，AIF-1确实可以作为炎症反应活跃程度的重要指标之一。

更令人感兴趣的是，同为小鼠结肠炎模型，溃疡性结肠炎的小鼠体内无论是肠道组织还是外周血内，AIF-1的表达均较细菌性肠炎小鼠为高，这一结果向我们提示了一个重要线索：作为来源于同种异体免疫反应且其序列高度保守的炎症因子，AIF-1对有着自身免疫背景的疾病更为敏感，因为已有的研究显示，溃疡性结肠炎与细菌性肠炎比较起来，前者更加存在着特异性的免疫反应，尤其是与自身免疫相关的反应，而后者的炎症反应相对来说缺乏特异性。考虑到这一特性，AIF-1可能参与了机体特异性的免疫反应机制，在溃疡性结肠炎中，则表现为参与了其特异性的免疫致病机制。同时，AIF-1的表达高低可以作为衡量特异性免疫反应或者自身免疫水平的指标[7]，当炎症反应局限于非特异性时，AIF-1仅低滴度表达，而一旦自身免疫反应或者某种特异性炎症反应启动，AIF-1迅速作出应答，形成高滴度表达。如果在以后的研究中如能扩展至临床，证实AIF-1在溃疡性结肠炎患者体内为高滴度表达而在非特异性肠炎患者体内为低滴度表达，则可更为有力的证实此点假说。

与之相对照的是IL-1β，IL-1β一直被认为是非特异性炎症反应的指标，其在诸多免疫反应中起着介导作用，但缺乏特异性。本实验中虽然观察到IL-1β在溃疡性结肠炎和细菌性肠炎的小鼠体内均有表达，但二者表达水平并无统计学差异，与AIF-1的表达水平差异形成鲜明对照，说明IL-1β虽然参与了结肠炎的发病机制，但其相对来说缺乏特异性，很可能在炎症通路中处于下游水平，并不能作为上游特异性启动机制存在[8]。而AIF-1与IL-1β之间无明显相关性亦说明了这一点，在溃疡性结肠炎发病机制中的地位，AIF-1确实可能较IL-1β更为特异性且更为上游层次。AIF-1至IL-1β的这一炎症反应及传导通路，确实有值得进一步探索的价值。

[1]Baumgart DC,Thomas S,Przesdzing I,et al.Exaggerated inflammatory response of primary human myeloid dendritic cells to lipopolysaccharide in patients with inflammatory bowel disease[J].Clin Exp Immunol,2009,157(3)：423-436.

[2]杨凤江,钟敦璟,俞 杨,等.溃疡性结肠炎患者血清P物质、血管活性肠肽及内皮素检测结果分析[J].海南医学,2013,24(13)：1954-1955.

[3]Thomas S,Baumgart DC.Targeting leukocyte migration and adhesion in Crohn's disease and ulcerative colitis[J].Inflammopharmacology,2012,20(1)：1-18.

[4]Zhang L,Zhao J,Li C,et al.Cloning and characterization of allograft inflammatory factor-1(AIF-1)from Manila clam Venerupis philippinarum[J].Fish Shellfish Immunol,2011,30(1)：148-153.

[5]崔路佳,王裕宣.溃疡性结肠炎患者肠道菌群改变与炎性指标的相关性研究[J].海南医学,2014,25(20)：3014-3016.

[6]CHEN Ji,DENG Zhan-sheng.Expression and significance of NF-κB and Th2 cytokines in human ulcerative colitis[J].China Journal of Modern Medicine,2010,20：3433-3436.

[7]Sommerville LJ,Kelemen SE,Ellison SP,et al.Increased atherosclerosis and vascular smooth muscle cell activation in AIF-1 transgenic mice fed a high-fat die[J].Atherosclerosis,2012,220(1)：45-52.

[8]Teramoto K,Miura S,Tsuzuki Y.Increased lymphocyte trafficking to colonic microvessels is dependent on MAdCAM-1 and C-C chemokine mLARC/CCL20 in DSS-induced mice colitis[J].Clin Exp Immunol,2010,139：421-428.

Research of AIF-1 and IL-1β expression in mice with ulcerative colitis in vivo.

LIU Xiang,ZENG Liu-yuan,LIN Hong.Department of Gastroenterology,the Second Affiliated Hospital of Guangzhou Medical University,Guangzhou 510260,Guangdong,CHINA

ObjectiveTo explore the roles of allograft inflammatory factor-1(AIF-1)and interleukin-1β(IL-1β)in the pathogenesis of ulcerative colitis.MethodsNinety BALB/c mice were randomly divided into three groups,each with 30 mices.In group 1,dextran sulphate sodium(DSS)was applied for modeling of ulcerative colitis, andE.coliwas applied for modeling of bacterial enteritis in Group 2.Group 3 was set as the normal control.Peripheral blood samples and colon tissues of mice were collected for detection of AIF-1 and IL-1βexpression level by ELISA.Results(1)In group 1,AIF-1 expression levels were(0.134±0.048)ng/ml in peripheral blood and(0.462±0.117)ng/ml in colon tissues,which were significantly higher than the levels in group 2[(1.425±0.229)ng/ml in peripheral blood, (1.261±0.48)ng/ml in colon tissues],P＜0.05.(2)There was no statistically significant difference in IL-1βexpression level between group 1[(0.894±0.173)ng/ml in peripheral blood,(1.261±0.048)ng/ml in colon tissues]and group 2 [(0.087±0.021)in peripheral blood,(0.149±0.057)in colon tissues],P＞0.05.(3)AIF-1 and IL-1βexpression levels in mice of bacterial enteritis or ulcerative colitis had no relevance(P＞0.05).ConclusionAIF-1 might be involved in the specific pathogenesis of ulcerative colitis,and IL-1βmay not participate in the pathogenesis.

Allograft inflammatory factor-1(AIF-1);Interleukin-1β(IL-1β);Ulcerative colitis;Pathogenesis

R-332

A

1003—6350（2015）21—3124—03

2015-03-28)

10.3969/j.issn.1003-6350.2015.21.1137

刘 翔。E-mail：liuxiang317@sohu.com