外周血游离肿瘤DNA测定在非小细胞肺癌患者中的应用价值

洪英财，陈怀生，林少霖，王正，杨林，王光锁，李富荣，黄同海

（暨南大学第二临床医学院深圳市人民医院胸外科，广东深圳518000）

外周血游离肿瘤DNA测定在非小细胞肺癌患者中的应用价值

洪英财，陈怀生，林少霖，王正，杨林，王光锁，李富荣，黄同海

（暨南大学第二临床医学院深圳市人民医院胸外科，广东深圳518000）

目的探讨Ion Torrent测定外周血DNA在非小细胞肺癌中的临床价值。方法选择患者80例，通过Ion Torrent测序测定其EGFR浓度，观察EGFR浓度与EGFR基因型及与吉非替尼治疗敏感情况的关系，并分析EGFR突变与否者的1年生存率。结果突变型EGFR 32例，野生型EGFR 48例，吉非替尼敏感者30例，吉非替尼不敏感者50例，突变型EGFR浓度明显高于野生型EGFR(P＜0.05)，对吉非替尼治疗敏感者的血清EGFR浓度显著高于吉非替尼治疗不敏感者(P＜0.05)。结论采用Ion Torrent测定外周血DNA技术了解患者基因型，有针对性的使用靶向治疗药物，其准确性更高，且能有效延长患者生存时间。

Ion Torrent测定；外周血DNA；非小细胞肺癌

肺癌是最常见的恶性肿瘤之一。由于其不易被早期诊断，且至今仍未有有效的治疗方案，导致肺癌的5年生存率低于15%，而基因治疗更有助于肺癌患者提高临床疗效，延长其生存时间[1]。循环DNA作为游离DNA主要出现在人体外周血或者体液中，而肿瘤患者循环DNA的来源尚不明确。有报道称，肿瘤细胞的凋亡是其主要的生成方式。研究还发现，非小细胞肺癌患者的血浆循环DNA会表现出极为异常的变化，提示循环DNA基因也可作为肿瘤标志物[2]。

Ion Torrent测序是第三代测序技术，其不但使DNA聚合酶自身反应速度得到实现，能够在一秒钟即可测10个碱基，相对于化学法测序其效率显著提高甚至超过2万倍，同时实现了DNA聚合酶内反应的自身延续，对于蛋白质片段的合成具有积极意义，显著提高了基因组的重复序列的拼接效率[3]。其能能够直接测RNA的序列，降低体外逆转录产生的系统误差[4]，并对甲基化的DNA序列进行直接的测定，更好的提高了基因测序效率，从而实现了基因层面对患者的外周血DNA进行检测，对非小细胞肺癌患者进行基因诊断和治疗的可行性[5]。本研究主要通过Ion Torrent测序了解患者EGFR基因型，并结合PCR测定EGFR浓度，评价Ion Torrent测定外周血DNA的价值，现报道如下：

1 资料与方法

1.1 一般资料选择2012年8月至2014年2月我院收治的非小细胞肺癌患者80例，所有患者均经临床表现、影像学检查以及病理组织活检确诊，其中Ion Torrent测序确定突变型EGFR 32例，野生型EGFR 48例，对吉非替尼治疗敏感者30例，对吉非替尼治疗不敏感者50例。

1.2 入选及排除标准入组标准：(1)经病理组织学/细胞学检查诊断为非小细胞肺癌；(2)年龄18～75岁；(3)ECOG评分0～2分；(4)预计生存期≥2个月；(5)主要器官功能正常；(6)自愿入组，签署知情同意书，依从性好，配合随访；(7)距离大手术4周以上。排除标准：(1)合并未能控制的中枢神经系统转移，具有颅高压表现；(2)具有出血倾向，特别是1个月内出现过明显的消化道出血；或正在接受溶栓或抗凝治疗；(3)30 d内使用过其他研究药物，或同时参加其他临床研究；(4)6个月内出现过心肌梗塞，或目前存在不稳定性心绞痛、心功能不全；(5)合并严重慢性阻塞性肺病和/或呼吸衰竭；(6)双侧胸腔大量积液或包裹性胸腔积液；(7)患者依从性差，或患有精神疾病；(8)已知对本试验用药及其辅料过敏；(9)目前存在未控制的严重感染；(10)妊娠期或哺乳期女性患者，不愿采取避孕措施的育龄患者(包括男性)。

1.3 Ion Torrent测序的工作原理以基因组学技术为基础，结合无创检测技术，通过采用新一代快速测序平台—第三代测序技术Ion Torrent，来对非小细胞肺癌患者外周血循环DNA进行检测，探索其在个体化用药指导上的价值。先将含测序的DNA样本置入微孔，然后使用数量巨大的且未经处理的核苷酸(DNTP)，依次穿过微孔；根据碱基互补配对原则DNA聚合酶会将相应核苷酸置入延伸链，通过延伸反映获得的氢离子直接改变反映体系的pH值，测序仪就可以这种变化为基础进行测序。

1.4 EGFR浓度测定所有非小细胞肺癌患者在均留取血样3 ml，并对癌组织中定量坏死组织，置入冰箱保存备用，在石蜡切片发现肿瘤细胞含量均高于70%。按照不同病理类型进行分组，置入枸盐酸钠抗凝剂(ACD)，保存在冰箱中，有效使用期为1周。DNA提取：所有标本的DNA抽提均用常规蛋白酶K消化、酚-氯仿抽提，经紫外分光光度计定量，将浓度稀释到350～450 ng/ml，-20℃保存备用。在50µl PCR反应体系中加入基因组DNA 1 μl，5 μl PCR缓冲液，dNTP 200µmol/L，每对引物各20 pmol/L，Taq DNA聚合酶0.5 U，在反应液表面加30µl高压消毒甘油；采用热启动法，97℃变性10 min，随后降至88℃，循环条件为94℃60 s，54℃～57℃60 s，72℃60 s，38个循环后72℃，延伸10 min。

1.5 研究方法所有患者均应用Ion Torrent测序技术测定其EGFR突变情况，了解其突变型与野生型比率，并通过临床验证得到对吉非替尼治疗敏感与否的比率。通过PCR技术测定EGFR浓度，观察EGFR浓度与EGFR基因型及与吉非替尼治疗敏感情况的关系，并分析EGFR突变与否者的1年生存率。

1.6 统计学方法应用SPSS13.0软件进行数据分析，计量资料以均数±标准差(±s)表示，两组间均数的比较使用t检验，生存情况使用Kaplan-Meier法进行生存分析，以P＜0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 EGFR突变与否者的EGFR浓度比较突变型(32例)的EGFR浓度为(1643.7±123.7)copy×105/ml，明显高于野生型(48例)的(648.9±81.5)copy×105/ml，差异有统计学意义(t=42.473，P＜0.05)。

2.2 吉非替尼敏感与否者的血清EGFR浓度比较对吉非替尼治疗敏感者30例，其血清EGFR浓度为(893.3±132.3)copy×105/ml，对吉非替尼治疗不敏感者50例，其血清EGFR浓度为(532.8±98.9)copy× 105/ml，两者的血清EGFR浓度比较差异有统计学意义(t=13.803，P＜0.05)。

2.3 EGFR突变与否的1年生存曲线比较突变型EGFR 1年生存26例，死亡6例，生存率为81.25%，野生型EGFR 1年生存36例，死亡12例，生存率为75.0%，两组患者的1年生存率比较差异无统计学意义(P＞0.05)。EGFR突变与否的1年生存曲线，见图1。

图1 EGFR突变与否1年生存曲线

3 讨论

肿瘤循环DNA主要是由少数衰亡细胞的DNA释放出来的。在健康状态下，循环游离DNA的释放与消除则会保持一种相对平衡的状态[6]。循环游离DNA可作为人体健康的评判标准[7]。其改变与多种疾病存在着密切联系。主要来源为[8]：①肿瘤细胞或微转移灶；②肿瘤细胞坏死或凋亡；③肿瘤细胞自行释放DNA。肿瘤组织释放出的DNA会逐渐进入血液，导致血浆DNA浓度升高。循环DNA与肿瘤组织细胞保持着相同的特异性。肿瘤患者在经过各种有效治疗后其外周血循环DNA的数量减少，而治疗后患者外周血循环DNA的浓度不降反升时，即提示患者生存率有所降低[9]。Ion Torrent测序技术借助了半导体芯片技术，和激光测序不同的是，它是建立在化学和数字信息基础之上的一种新型技术[10]。

EGFR突变为外显子E19 del和外显21 L858 R突变，能够在接近50%的患者身上监测到，其诱发的酪氨酸激酶活化，是靶向治疗药物厄洛替尼、吉非替尼治疗活性的指标之一[11]。EGFR基因突变检测是以肿瘤组织样本为基础的。但是中晚期肺癌患都不耐受手术，导致较难获得肿瘤组织样本，虽然可以采用纤维支气管镜活检组织，但其会造成较大创伤，不适用于大部分患者。所以在需要进行多人筛查或病情进展检查时，通过组织标本检测EGFR基因突变能更好的为临床治疗提供依据。其中外周血样本获取较为容易、且会创伤微小，可用于病情监测优质标本。但在血行转移前外周血中循环癌细胞非常少，常规方法很难在外周血中检测出癌细胞EGFR基因突变。Ion Torrent测定外周血DNA基因突变的灵敏度和特异性越来越高，使EGFR基因突变检测方法得到了巨大的发展。

采用Ion Torrent测定外周血DNA技术对血浆总游离DNA定量分析在提取血浆游离DNA时目前尚无统一标准[12]，导致不同实验室最终测量的血浆DNA水平不一样，实验结果无法进行比较[13]。但随着技术的不断进步，随着Ion Torrent测定外周血DNA技术逐渐成为被广泛应用于分子生物学研究，通过与其他分子生物学技术的联合使用提高了极微量基因测试水平[14]，能够准确检测微量游离DNA，了解患者基因型，有助于肿瘤的早期诊断和疗效评估等。患者状态会对血浆游离DNA产生较大影响，因此联合多个靶基因有助于游离DNA的测定[15]。本研究结合常规使用的PCR技术进行检测后发现，突变型EGFR其EGFR浓度显著高于野生型EGFR者，对吉非替尼治疗敏感者其血清EGFR浓度显著高于吉非替尼治疗不敏感者。且通过Ion Torrent测定外周血DNA基因检测针对性的使用吉非替尼靶向治疗后，对于EGFR突变与否患者，其1年生存率差异无统计学意义。

综上所述，采用Ion Torrent测定外周血DNA技术了解患者基因型，有针对性的使用靶向治疗药物，其准确性更高，且能有效延长患者生存时间。

[1]李栋,何建行,邱源,等.非小细胞肺癌患者血清游离DNA中COX-2拷贝数检测[J].广州医学院学报,2008,36(2):1-4.

[2]张弦,唐立.非小细胞肺癌患者血中DNA片段的检测、定量及临床意义的研究[J].中国微生态学杂志,2007,19(6):516-518.

[3]Pop LA,Puscas E,Pileczki V,et al.Quality control of Ion Torrent sequencing library[J].Cancer Biomark,2014,14(2):93-101.

[4]张得芳,马秋月,尹佟明,等.第三代测序技术及其应用[J].中国生物工程杂志,2013,33(5):125-131.

[5]蔡贞,郑磊.多靶标基因并行检测技术为肿瘤个体化治疗提供新模式[J].分子诊断与治疗杂志,2013,5(6):361-366.

[6]刘歆,徐根明,郭江峰,等.基于SYBR green I的双链DNA定量方法[J].中国生物工程杂志,2008,28(1):55-60.

[7]秦绪珍,崔巍.循环游离DNA EGFR突变检测在非小细胞肺癌药物反应性中的临床应用[J].中国卫生检验杂志,2008,18(7): 1464-1466.

[8]Hassan SM,Vossen RH,Chessa R.Molecular diagnostics of the HBB gene in an Omani cohort using bench-top DNA Ion Torrent PGM technology[J].Blood Cells Mol Dis,2014,28(5):1079-1096.

[9]管忠震,张力,李龙芸,等.吉非替尼治疗局部晚期或转移性非小细胞肺癌在中国的临床研究[J].癌症,2005,24(8):980-984.

[10]Angelidaki I.Analysis of bacterial communities and bacterial pathogens in a biogas plant by the combination of ethidium monoazide, PCR and Ion Torrent sequencing[J].Water Res,2014,60(1): 156-163.

[11]朱艳慧,贺树香,王晓春,等.通往个性化医疗的新一代测序技术: Ion Torrent[J].生物技术通讯,2013,24(4):587-591.

[12]周小昀,李龙芸,崔巍,等.检测肺癌患者血清游离DNA的EGFR基因点突变与EGFR-TKI疗效的相关性分析[J].癌症进展, 2011,9(1):13-18.

[13]Tsongalis GJ,Peterson JD,de Abreu FB,et al.Routine use of the Ion Torrent AmpliSeq™Cancer Hotspot Panel for identification of clinically actionable somatic mutations[J].Clin Chem Lab Med, 2014,52(5):707-714.

[14]赵学维,孙光远,李兵,等.EGFR在非小细胞肺癌中的表达及临床意义[J].现代肿瘤医学,15(7):919-922.

[15]汪雨来,罗效梅,涂植光.血浆循环DNA在肺癌诊断上的应用[J].武警医学,2005,16(8):570-572.

Value of peripheral blood DNA determination by Ion Torrent in patients with non-small cell lung cancer.

HONG Ying-cai,CHEN Huai-sheng,LIN Shao-lin,WANG Zheng,YANG Lin,WANG Guang-suo,LI Fu-rong,HUANG Tong-hai.Department of Thoracic Surgery,Shenzhen People's Hospital,the Second Clinical Medical College of Jinan University,Shenzhen 518000,Guangdong,CHINA

ObjectiveTo evaluate the clinical value of peripheral blood DNA determination by Ion Torrent in patients with non-small cell lung cancer.MethodsEighty patients of non-small cell lung cancer were enrolled,in which the epidermal growth factor receptor(EGFR)concentration was measured with Ion Torrent,Then the relationships between EGFR levels,EGFR genotype,and sensitive situation of gefitinib therapy were investigated,and one-year survival rate of the patients with or without EGFR mutation were analyzed.ResultsAmong the 80 patients,32 had mutant EGFR and 48 had wild-type EGFR.Thirty patients were sensitive to gefitinib and 50 were not sensitive to gefitinib.Levels of EGFR in mutant EGFR was significantly higher than those in wild-type EGFR(P＜0.05).And the levels were significantly higher in gefitinib-sensitive patients than patients not sensitive to gefitinib(P＜0.05).ConclusionPeripheral blood DNA measured with Ion Torrent can ientify the patients’genotype and target therapies,which results in higher accuracy and prolonged survival time.

Ion Torrent;Peripheral blood DNA;Non-small cell lung cancer

R734.2

A

1003—6350（2015）01—0053—03

10.3969/j.issn.1003-6350.2015.01.0017

2014-07-09)

2012年度广东省医学科学技术研究基金项目（编号：A2012566）

陈怀生。E-mail：hyc55@126.com