三叉神经痛大鼠三叉神经节内谷氨酸表达分布的研究

胡秀敏，江远仕，张盛涨

(1.广东医学院，广东湛江524023；2.广东医学院附属福田区人民医院汕头大学第二附属医院耳鼻喉头颈外科，广东深圳518000；3.广东医学院附属深圳市福田区人民医院耳鼻喉头颈外科，广东深圳518000)

三叉神经痛大鼠三叉神经节内谷氨酸表达分布的研究

胡秀敏1，江远仕2，张盛涨3

(1.广东医学院，广东湛江524023；2.广东医学院附属福田区人民医院汕头大学第二附属医院耳鼻喉头颈外科，广东深圳518000；3.广东医学院附属深圳市福田区人民医院耳鼻喉头颈外科，广东深圳518000)

目的研究三叉神经痛(TN)大鼠时其三叉神经节(TG)内谷氨酸(Glu)表达与分布的关系。方法皮下注射硝酸甘油构建三叉神经痛大鼠模型；应用免疫组化技术检测大鼠三叉神经节Glu含量与分布。结果皮下注射硝酸甘油构建三叉神经痛大鼠的三叉神经节内Glu含量增多且其主要分布在三叉神经节表层。结论Glu可能与三叉神经痛发生有密切关系。

硝酸甘油；谷氨酸；三叉神经痛；三叉神经节

三叉神经痛(TN)是一种原发性神经痛，累及面部三叉神经一支或两支分布区，表现为反复性、慢性头痛。发作时表现为以面颊上下颌及舌部明显的剧烈电击样、针刺样、刀割样或撕裂样疼痛，突发突止，间歇期完全正常，可伴有恶心、呕吐、畏声、畏光等症状。目前三叉神经痛发病机制还不是很清楚。谷氨酸(Glu)是公认的神经系统兴奋性递质，它能通过谷氨酸受体参与三叉神经系统内的痛觉信息的传递[1]，Glu也是神经系统分布很广泛的一种重要的神经递质，广泛参与各种神经的调节，可能与三叉神经痛的发作有密切联系。

1 材料与方法

1.1 材料①实验动物与分组：健康SD大鼠16只，体重220～260 g；由广东省实验动物中心提供动物编号：SCXK(粤)2013-0008。实验动物合格证号：按体重均衡原则将大鼠随机分成对照组(生理盐水，n=8只)、模型组(硝酸甘油组，n=8只)，分别皮下注射硝酸甘油与生理盐水后，1 h灌注取材。②主要试剂与仪器：硝酸甘油(广州明兴制药有限公司，批号MC 2407)，兔抗鼠谷氨酸多克隆抗体(Millipore Corporation，一抗)，批号：2204896，PV-6001二步法免疫组化检测试剂(北京中杉金桥生物有限公司)。

1.2 方法

1.2.1 大鼠三叉神经痛模型的建立参照Tassorelli等[2]皮下注射硝酸甘油，SD大鼠按10 mg/kg颈部皮下注射硝酸甘油。一般注射后5～10 min大鼠出现双耳发红、爬笼次数增多、后肢频繁挠头、烦躁不安等现象，约40 min后达到高峰。此现象可持续3～5 h，之后大鼠呈现蜷卧、活动减少状态，此为造模成功。对照组大鼠皮下注射等体积生理盐水，大鼠仅在20 min内略有挠头现象，之后趋于正常，也未出现双耳发红、爬笼次数增多和其他烦躁不安现象。

1.2.2 免疫组化标本留取对照组在皮下注射生理盐水、模型组注射硝酸甘油1 h后，然后用10%的水合氯醛以400 mg/kg给大鼠腹腔麻醉，打开胸腔，在心尖处剪一个小口，灌注针经左心室插入升主动脉，同时把右心耳剪开以便于血液以及灌注液流出，另一端接50 ml注射器，开始先用生理盐水快速灌注大约500 ml生理盐水至肝脏变白，右心流出生理盐水，再注射约200 ml 4%的多聚甲醛(溶于0.1 mol/L磷酸缓冲液，pH 7.4)溶液，灌注先快后慢大约20 min灌完，在灌注之前可以先注射适量肝素使血液肝素化。灌注过程中用止血钳止住腹主动脉，固定后断头取三叉神经节，置于4%多聚甲醛0.1 mol/L PBS液中固定4 h。全自动脱水机脱水后石蜡包埋，石蜡切片机切片，切片厚度为3µm，贴于APES硅胶防脱载玻片上，63℃12 h烤干备用。切片常规脱蜡至水，4罐二甲苯依次脱蜡8 min后无水乙醇(100%、95%、85%、75%)脱水依次3 min，热修复抗原：将切片放入盛有0.01 mol/L枸橼酸钠缓冲溶液(pH 6.0)对抗原中进行修复，自然冷却后PBS洗3遍，3%H2O2室温孵以灭活内源性酶活性进行封闭，然后暗室室温10 min，PBS洗3遍，滴加一抗(Anti谷氨酸抗体，兔抗大鼠1:2 000，购于Millipore Corporation)，4℃冰箱过夜，复温30 min，PBS漂洗3次，每次2 min；滴加二抗(PV-6001北京中杉金桥生物有限公司)，室温90 min，PBS漂洗3次，每次2 min；二氨基联苯胺(Diaminobenzidine，DAB)显色，蒸馏水冲洗5 min，苏木精复染1 min，梯度酒精脱水，蒸馏水冲洗5 min，二甲苯透明,中性树胶封片。阴性对照用0.01 mol/L的PBS代替一抗显色，其他步骤不变，结果均为阴性。为了保证可比性，实验组和对照组切片在同一反应条件、同一染缸中进行，其他反应条件保持不变。

1.3 图像分析TG染色后，显微镜下拍照，用Image tool图像分析系统观察分析光密度。

1.4 统计学方法应用SPSS11.5统计软件进行数据分析，计量数据均以均数±标准差(±s)表示，组间数据间的统计采用方差分析。以P＜0.01为差异有显著统计学意义。

2 结果

皮下注射硝酸甘油组大鼠谷氨酸阳性免疫反应细胞主要分布在三又神经节表层细胞，TG的神经细胞内呈棕褐色染色，位于胞浆、胞核处，胞核素木苏复染呈现蓝色。注射生理盐水组大鼠TG谷氨酸感觉神经元大部分呈现阴性反应。于每只大鼠TG切片中隔5张取1张切片，用图像分析系统软件分析Glu阳性神经元的光密度变化。硝酸甘油组和生理盐水组阳性神经元的平均光密度分别为(0.354 5±0.257 1)和(0.166 2±0.064 3)。硝酸甘油组TG中Glu的表达较生理盐水组明显增加(F=403.387，P＜0.01)，见图1。

图1 谷氨酸在各组SD大鼠三叉神经节中的表达

3 讨论

三叉神经痛是临床上一种比较常见的疾病，具有广泛的发病年龄，从10岁到90岁均可发病，其中以40岁以上的中年人居多，近年来儿童的发病率逐渐增加，女性多见。三叉神经痛以两侧或一侧面部三叉神经分布区内反复发作的阵发性剧烈痛为主要表现，发作时表现为以面颊上下颌及舌部明显的剧烈电击样、针刺样、刀割样或撕裂样疼痛，突发突止，间歇期完全正常，可伴有恶心、呕吐、畏声、畏光等症状，严重影响患者的生命质量，被认为是人类最痛苦的疾病之一。三叉神经分为继发性和原发性三叉神经痛，以后者多见，且发病机制与病因不明，可能涉及外周、中枢及免疫因素等。继发性三叉神经痛是由于肿瘤、外伤、炎症等原因引起的痛，目前临床上虽然有多种治疗方法，但效果均不理想。

本实验通过硝酸甘油组与生理盐水组作比照，硝酸甘油组Glu表达明显高于生理盐水组，通过Glu表达与分布揭示TN与Glu的密切关系。对神经递质Glu与疼痛的研究，至今仍是社会研究的一个热点，21世纪的大量研究表明，Glu在各种类型疼痛中均具有一定的重要作用，Glu作为神经系统内普遍存在的一种兴奋型神经递质，在口面部信息感觉的传递中同样发挥重要作用。研究人员研究发现，谷氨酸是负责TN信息传递和调节的关键递质而且口面部痛觉的异常敏化就伴随三叉神经传导路上谷氨酸释放的异常增多[3-5]。有实验表明，在大鼠组织发生炎症或神经损伤所致的病理性疼痛时，外周或脊髓内谷氨酸水平升高[6]。

目前，临床上治疗TN方法也众多，药物品种更是繁多，药物治疗如普坦类佐米曲普坦可以抑制三叉神经神经元的兴奋性，曾被喻为治疗三叉神经痛的“金标准”[7]。手术治疗如微血管减压术、神经周围支撕脱术、颅底神经高位切除切断术、经皮穿刺射频温控热凝治疗等[8]，但效果均不理想，且容易复发。TN的理想术式是能做到选择性毁损痛觉纤维，保留其他的感觉和运动纤维，减少并发症，降低复发率。实施高度选择性切断三叉神经感觉跟(TNSR)上的痛觉纤维，保留其他感觉及运动纤维治疗TN是基础和临床的重要课题，江远仕等[9-10]开展TNSR的表层神经纤维束切断术(STS)。术后患者痛觉消失，运动、温度、触压觉功能保留尚完好，从临床上证明了三叉神经痛的痛觉纤维可能位于三叉神经节的表层。

由本实验推测，在三叉神经节表面初级传入纤维中，谷氨酸可能作为一种神经递质作用于突触后膜上的谷氨酸受体而直接参与伤害性信息的传递，导致中枢敏化，从而导致大鼠三叉神经支配区面部和口腔疼痛。

综上所述，Glu可能存在于三叉神经节的表层并且参与TN的病理生理过程，其与三叉神经痛发生有密切关系。

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Distribution of glutamic acid expression within the trigeminal ganglia in rats with trigeminal neuralgia.

HU Xiu-min1,JIANG Yuan-shi2,ZHANG Sheng-zhang3.1.Guangdong Medical College,Zhanjiang 524023,Guangdong, CHINA;2.Department of Otolarynogology-Head and Neck Surgery,People's Hospital of Futian District of Shenzhen Affiliated to Guangdong Medical School,the Second Affiliated Hospital of Shantou University,Shenzhen 518000, Guangdong,CHINA;3.Department of Otolarynogology-Head and Neck Surgery,People's Hospital of Futian District of Shenzhen Affiliated to Guangdong Medical School,Shenzhen 518000,Guangdong,CHINA

ObjectiveTo study the distribution of glutamate(Glu)expression within the trigeminal ganglia (TG)in rats with trigeminal neuralgia(TN).MethodsRats models with TG were constructed by subcutaneous injection of nitroglycerin trigeminal neuralgia.Immunohistochemical technique was applied to detect the contents and distribution of Glu.ResultsThe level of glutamic acid was found increased in trigeminal ganglion in the rat models, and it was mainly distributed in the surface layer of trigeminal ganglion.ConclusionGlu may have close relationship with TN.

Glyceryl trinitrate;Glutamate;Trigeminal neuralgia;Trigeminal ganglion

R-332

A

1003—6350（2015）01—0015—03

10.3969/j.issn.1003-6350.2015.01.0005

2014-07-29)

广东省自然科学基金（编号：040112155）；深圳市重点科研基金（编号：20110421225）

江远仕。E-mail：jysh@163.com