重组人皮肤表皮在医疗器械检验领域中的应用探讨

黄经春 孙立魁 孙晓霞 范春光 孙永超 济南市卫生学校；国家食品药品监督管理局济南医疗器械质量监督检验中心，山东省生物学评价重点实验室 （济南 250101）

1.研究背景及意义

毒理学安全性评价中减少动物使用已成为 趋势[1]，新型生物材料重组人皮肤表皮的出现为皮肤刺激试验体外替代方法提供了载体[2]，ISO/TC194 医疗器械生物学评价技委会已准备开展将重组人皮肤表皮应用到医疗器械检验的验证[3]。新型生物材料代替实验动物应用到医疗器械检验，能够充分体现替代、减少、优化的“3R”原则，在保护实验动物方面能够发挥非常重要的作用。现应用重组人皮肤表皮模型EpiDerm™和家兔分别进行医疗器械皮肤刺激试验,比较两种方法结果的一致性。

2.材料与方法

2.1 重组人皮肤表皮皮肤刺激试验

2.1.1 试验原理

对皮肤刺激阳性对照1%十二烷基硫酸钠(SDS)、阴性对照生理盐水、棉籽油及受试物（某医用敷贴按面积6:1 比例制备的浸提液[4]）分别作用于重组人皮肤表皮，接触一定时间后用MTT 法测试细胞相对活性，如果细胞的相对活性≤50%，认为受试物具有刺激性[5]。

图1. EpiDerm ™试剂盒

图2. 镜下观察组织病理

图3. 重组人皮肤表皮皮肤刺激试验结果统计

2.1.2 表皮模型

EpiDerm™试剂盒每盒包含有24 个表皮亚单位（见图1）

2.1.3 试验方法

（1） 将液体受试物100μL 直接滴在表皮表面，在37˚C5%CO2孵箱中孵育15min 之后，每块表皮至少用10mLPBS 清洗一次，然后再孵育18h，让受试物与组织充分作用。

（2） 将表皮与MTT 溶液在37˚C5%CO2孵箱中孵育3h，避光放置，分离表皮和胶原基质，在室温中置于2mL 酸性异丙醇24h。

（3） 将萃取物（200μL）转移到96 孔板，在570nm 测OD 值，酸性异丙醇为空白对照。对照表皮的OD 值必须界于0.6-0.9，并且1%SDS 处理的阳性对照表皮的细胞活性在0-20%之间。

（4） 每个受试物需要作用于三个表皮，并用三个批号的皮肤模型产品。如果细胞的相对活性≤50%，则受试物具有刺激性。

2.1.4 重组人皮肤表皮皮肤刺激试验试验结果

2.2 家兔皮肤刺激试验

2.2.1 试验动物

2.2.2 试验方法

家兔于试验前将背部脊柱两侧被毛除去(约10cm×15cm 区域)作为试验和观察部位。将皮肤刺激阳性对照1%SDS、阴性对照生理盐水、棉籽油及受试物，某医用敷贴按面积6:1 比例制备的浸提液分别浸透纱布敷贴接触动物皮肤，于接触后24、48、72 小时，对接触部位红斑、水肿记分，将每只动物在每一规定的时间试验材料引起的红斑与水肿的原发性刺激记分相加后再除以观察总数之和，用试验材料原发性刺激记分减去阴性对照的原发性刺激记分即为原发性刺激指数（PII），PII>0.4 认为受试物具有刺激性[6]。

2.2.3 家兔法试验结果

家兔法测试1%SDS 阳性对照原发性刺激指数PII 为5.6，阴性对照生理盐水、棉籽油原发性刺激指数PII 均为0，医用敷料浸提液（生理盐水）、医用敷料浸提液（棉籽油）原发性刺激指数PII均为0。

图4. 新西兰家兔

3.重组人皮肤表皮和家兔法皮肤刺激试验结果判定

表1. 重组人皮肤表皮和家兔法皮肤刺激试验结果判定

4.结论

1%SDS 处理的阳性对照表皮细胞的相对活性为5%，具有刺激性。受试物和阴性对照细胞的相对活性均大于50%，表明受试物无刺激性。家兔法测试1%SDS 阳性对照原发性刺激指数PII 为5.6，具有刺激性。受试物和阴性对照原发性刺激指数均为0，表明受试物无刺激性。重组人皮肤表皮与家兔试验评价结果相一致，新型生物材料重组人皮肤表皮有望代替实验动物在医疗器械检验领域的应用。

5.讨论

（1）家兔和人皮肤的生理特征存在差异，有些物质在兔皮肤上表现出更强的毒性，家兔皮肤刺激性因敏感性过低而广受责备。重组人皮肤表皮刺激试验采用表皮细胞直接接触法更加敏感，且传统皮肤刺激试验使用动物数量多，具有刺激性的受试物给动物带来极大的痛苦，造成伦理方面的压力，此方法若能通过国际间的验证形成标准并得到相关部门认可和组织实施，新型生物材料重组人皮肤表皮将有望代替家兔在医疗器械检验领域应用，也将对实验动物保护事业做出巨大贡献。

（2）我国医疗器械生物学评价体外替代方法研究起步晚，发展慢，重组人皮肤表皮刺激试验在医疗器械检验领域的应用尝试，为医疗器械生物学评价替代方法提供了新的研究领域，我们应尽快与国际接轨，采用更多的体外替代试验方法来取代传统的动物试验。

[1] 中华人民共和国国家标准《医疗器械生物学评价 第2 部分：动物保护要求》GB/T16886.2-2000 idt ISO10993-2:1992

[2] João Barroso, The ECVAM validation of alternative tests for acute skin irritation

[3] J.W. Casas, In vitro human skin irritation test for evaluation of medical device extracts, Toxicology in Vitro 2013, 27 2175–2183

[4] 中华人民共和国国家标准《医疗器械生物学评价 第12 部分：样品制备与参照样品》GB/T16886.12-2005 idt ISO10993-12:2002

[5] 彭双清 郝卫东 伍一军，毒理学替代法[M], 北京 军事医学科学出版社2009

[6] 中华人民共和国国家标准《医疗器械生物学评价 第10 部分：刺激与迟发型超敏反应试验》GB/T16886.10-2005 idt ISO10993-10:2002