人全血IL-1β 试验在医疗器械体外热原检测中的应用前景探讨

范春光 孙立魁 刘成虎 李娜 侯丽 国家食品药品监督管理局济南医疗器械质量监督检验中心，山东省医疗器械生物学评价重点实验室 （济南 250101）

1.背景

热原检测是医疗器械生物学安全评价中的重要项目。医疗器械热原反应主要分为内毒素介导的热原反应、材料介导的热原反应[1]以及病毒[2]、真菌及其碎片[3]介导的热原反应。其中材料介导的热原反应物主要有内源性热原（如IL-1、IL-6, TNFα、INF-γ）、前列腺素、诱导剂（如多聚核糖核苷酸、多聚生物原酸）、干扰体温调节中枢的物质（如LSD、可卡因、吗啡）、氧化磷酸化解偶联剂（如二硝基酚）、细菌外毒素（如TSST-1、SEA、Spe F）、神经递质（如去甲肾上腺素）以及某些应用情况下的金属（如镍盐）[1]。常见的致热原多为外致热原，外致热原进入人体后可激活体内产生致热原细胞如单核细胞、巨噬细胞等[4]，使其产生IL-1[5], IL-6, TNFα[6]等内生致热原，内生致热原可通过血-脑脊液屏障直接作用于体温调节中枢使调定点上移，机体产热增多散热减少从而引起发热。

目前，医疗器械热原检测试验共有两种：鲎试剂法（细菌内毒素检测法）和兔法。其中鲎试剂法是通过检测医疗器械浸提液中细菌内毒素的含量来反映医疗器械致热原的情况。而兔法则是将医疗器械浸提液经耳缘静脉注入兔体内后根据兔的体温变化来反映样品热原情况。传统的方法有其局限性，鲎试剂法的局限性有以下几点：（1）如前所述，除细菌内毒素以外还有很多种致热原，而鲎试剂法只能检测细菌内毒素，所以它的检测谱不全面。（2）它只能检测医疗器械浸提液。（3）鲎资源有限。兔法的局限性有以下几点：（1）兔与人有种属差异，兔热原反应的情况不能完全等同于人的情况。（2）兔法同样只能检测医疗器械浸提液；（3）兔法稳定性比较差。（4)兔法为动物实验，而体外试验替代动物实验也是国内外的发展趋势。

2009 年，欧洲药典收录了体外热原检查法，美国FDA 也接受了5 种基于人免疫细胞的注射用药热原体外试验法[7]。这一类方法将供试品与人全血或细胞系孵育，然后测定产生的细胞因子的量来反映供试品中热原物质的量。研究[8]表明，人全血IL-1β 试验是较为理想的体外检测法。在本实验中，我们验证了人全血IL-1β 试验的效果，并探讨了此方法在医疗器械体外热原检测中应用的可行性。

2.试验材料及仪器

2.1 试验材料

人抗凝新鲜全血（至少4 人混合），无菌无热原生理盐水（山东齐都药业有限公司，批号：1D13051304），人IL-1β ELISA 试剂盒（ExCell，批 号：ZKZFBZAB01）， 脂 多 糖O113（LPS O113）（LIST BIOLOGICAL，批号：4331B1），脂磷壁酸（LTA）（SIGMA，批号：022M4026V）

2.2 仪器

采血管（BD，K2EDTA，批号：2030578），采血针（BD，0.6×20mm×180mm，批号：1349187），无菌无热原1.5mL 反应管（AXYGEN，批号：311-08-081），15mL 反应管（AXYGEN，批号：100525-02904），微量移液器（eppendorf，1μL-5mL），无菌无热原枪头（湛江博康海洋生物有限公司，250μL-1mL，批号：20120730），离心机（SIGMA，型号：1-14K），37˚C 培养箱（memmert，型号：ICP700），250˚C 烘箱（BINDER，型号：FED240），酶标仪（Thermo，型号：Multiscan MK3）

3.试验方法

3.1 采血

选取4 名健康志愿者（24-29 岁，三男一女，两周内未服药）采用无菌无热原抗凝采血管静脉采血，采血后经白细胞分类计数以排除感染，等体积混合，4 小时内使用。

3.2 加样孵育

（1）将1mL 生理盐水加入1.5mL EP 管，平行准备数管，另取数管分别加入100μL 浓度为0、100、200、400、600、800 pg/mL（溶于生理盐水）的LPS O113，分别标记为R0、R1、R2、R3、R4、R5，用于制作浓度反应标准曲线。

（2）取1.5mL EP 管加入1mL 生理盐水，再加入100μL 0.5 μg/mL 的LTA 溶液；另取1.5mL EP 管加入900uL 生理盐水，再加入100μL 0.5 μg/mL 的LTA 溶液，再加入100μL R2 (200 pg / mL)，用于计算内毒素回收率。在加入血液之前混合物要在无菌操作台放置至少1h。

（3）将100μL 混匀的抗凝鲜血加入到每一个反应管内，使总体积为1200μL，盖上各反应管，轻轻混匀。

（4）将反应管静置于37˚C，5%CO2 潮湿培养箱内过夜（14-24 h），13000g 离心2min，取上清。

3.3 测定

按人IL-1β ELISA 试剂盒说明书操作测定各反应管上清IL-1β 的含量。

3.4 计算

（1）根据试剂盒中IL-1β 标准品浓度梯度与相应的吸光度值（OD 值）建立标准曲线。根据得到的回归方程计算各反应管内IL-1β 的含量。

（2）根据不同浓度梯度的内毒素O113 的量与相应的IL-1β 的含量建立标准曲线并计算回归方程。

（3）计算试验溶液的内毒素当量及其内毒素回收率。根据曲线回归方程分别计算出试验溶液和加内毒素后的试验溶液的内毒素含量A 和B，按照以下公式计算该试验条件下内毒素的回收率。回收率= (B-A)/ R2×100%。当回收率在50%～200%之间，则认为在此试验条件下试验溶液不干扰试验系统。

4.结果

4.1 根据试剂盒中IL-1β 标准品浓度梯度（y）与相应的吸光度值（OD 值）（x）建立了标准曲线1（图1）。线性回归方程为：y = 82.345x2+ 166.63x – 3.4265，R = 0.999

4.2 根据以上回归方程计算得到各反应管内IL-1β的含量，根据不同浓度梯度的内毒素O113 的量（x）与相应的IL-1β 的含量（y）建立标准曲线2（图2）并得到回归方程：y = 112.34Ln(x) - 281.12，R= 0.990，线性范围（pg / mL）：100 – 800，检出限：100 pg / mL。

4.3 根据曲线回归方程得到了试验溶液的内毒素当量A 为105.8 pg / mL。加内毒素后的试验溶液的内毒素当量B 为219.0 pg / mL。回收率= (BA)/ R2 ×100%=56.6%。回收率在50%～200%之间，符合要求。

图1. 标准曲线1

5.讨论

多年以来，人们一直在研究热原体外试验方法，研究应用不同实验材料的可行性，如新鲜人全血、冻存人全血、人单核细胞系[7]、兔血[9]等，研究检测不同细胞因子的敏感性，如IL-1、IL-6、TNFα、INF-γ 等[8,9]。众多研究表明，人全血IL-1β 试验是最为理想的体外检测法。

在医疗器械热原检测中，人全血IL-1β 试验与传统方法相比有诸多优势。与鲎试剂法相比，此试验方法有以下优势：（1）检测范围更广，此方法不仅可以检测内毒素类致热原，还将大部分非内毒素类的致热原如细菌外毒素、病毒、真菌及其碎片及核糖核苷酸等能够刺激机体产生IL-1β 的外致热原纳入检测范围。在本实验中，LTA 为非内毒素类的致热原，鲎试剂法是无法检测的。（2）在最低检出限方面，鲎试剂法所有内毒素的阈值是100pg/mL 或1ng/mL，人全血法为1pg/mL 至10ng/mL 不等[10]，我们此次试验的最低检出限为100pg/mL，与以上研究结果相符，其最低检出限优于鲎试剂法。（3）能够实现定量分析。鲎试剂法是采用的定性分析，对于高于其内毒素阈值的物质均发生凝集反应，无法实现定量分析，本法可在其线性范围内实现定量分析。相较于兔法，此试验方法优势如下：①采用人全血检测，不存在种属差异问题，更能够准确、客观反应致热原在人体内的热原反应情况，结果更可信。②在最低检出限方面，LTA 浓度0.5 μg/mL 为兔法的检出限[8]，在本次试验中此浓度的LTA 也能够成功定量，但兔法结果可重复性较差，结果不够稳定，而新方法操作性强，便于通过制定统一标准，实现较高的稳定性。③兔法是动物试验，本方法是体外实验符合3R 原则。 若新方法应用于医疗器械的热原检测，与传统方法相比除以上优势以外，理论上还有一个独特的优势。传统的医疗器械的热原检测方法都是只能检测医疗器械浸提液，研究表明，按照现有的浸提方法我们无法保证医疗器械中致热原特别是其表面粘附的细菌碎片等残留物有效浸提出来[11]，而且有研究发现，移植物表面粘附的细菌碎片释放的内毒素是导致移植失败的重要原因[12]。而在新方法中，某些医疗器械如小型支架或易于取样和制备的医疗器械可以直接放入反应容器与人新鲜全血一起孵育，这样就可以将医疗器械表面不容易浸提下来的致热原纳入检测范围，结果会更加客观、准确。

人全血IL-1β 试验在医疗器械热原检测中应用之前，还要解决很多问题：新方法还需要在不同实验室之间进行比对，制定试验系统的标准操作规程，研究试验系统的灵敏度、特异性及稳定性，研究新方法的具体适用范围，研究样品制备方式，研究制定科学的判定标准等。这一系列问题都需要在接下来的工作中解决。相信在后续的工作中，新方法会不断完善，最终能够成熟地应用于医疗器械的生物学安全评价系统中，为医疗器械的临床使用提供更为有效的保障。

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