药用真菌星裂硬皮马勃的生药学研究*

王大可，宫诗林，许利婷，周 贤，王淑敏**

（1．长春中医药大学药学院，吉林 长春 130117；2．中国药科大学药学院，江苏 南京 210009）

药用真菌星裂硬皮马勃的生药学研究*

王大可1，宫诗林2，许利婷1，周 贤1，王淑敏1**

（1．长春中医药大学药学院，吉林 长春 130117；2．中国药科大学药学院，江苏 南京 210009）

对药用真菌星裂硬皮马勃进行生药学研究，为其开发应用提供依据。采集星裂硬皮马勃子实体，通过性状鉴别、菌丝和孢子显微特征观察，结合文献资料鉴定种类。利用薄层色谱建立星裂硬皮马勃专属性薄层鉴别特征，利用高效液相色谱法测定其化学成分含量。经过性状及显微特征观察，确定为药用真菌星裂硬皮马勃（Scleroderma polyrhizum Pers．）。薄层鉴别研究发现具有多个专属性的薄层色谱斑点，并含有麦角甾醇。高效液相色谱法测定其麦角甾醇含量为0．18%、甘露醇含量为0．50%。通过星裂硬皮马勃性状鉴别、扫描电镜下菌丝和孢子特征观察、薄层色谱鉴别，可综合鉴别星裂硬皮马勃的真伪，为其鉴别提供了参考依据。麦角甾醇和甘露醇含量可作为其质量控制的重要指标，也为今后星裂硬皮马勃开发利用提供科学数据。

星裂硬皮马勃；生药学；麦角甾醇；甘露醇

星裂硬皮马勃 （Scleroderma polyrhizum Pers．）是生长在阔叶林带中一种常见的食（药） 用真菌，别名多根硬皮马勃。属于硬皮马勃目（Sclerodermatales)硬皮马勃科（Sclerodermataceae)硬皮马勃属（Scleroderma）。夏秋季林中地上单生，可与云杉、松、栎形成外生菌根。幼时可食，味较好。子实体具有消肿、止血、解毒等功效，可用于治疗消化道出血和外伤出血等。因此，研究星裂硬皮马勃生药学特征可为今后其食药用提供科学依据。

1 实验仪器与材料

XS-213型生物显微镜，石家庄显微镜艾迪科教设备有限公司；XL 30 FEG Scanning Electron Microscope，FEI公司；LC-20AT高效液相色谱仪，日本岛津公司；RID-10A示差折光检测器。麦角甾醇、甘露醇对照品购于中国药品生物制品检定所；甲醇为色谱纯，美国Fisher公司；水为超纯水（18．2 ΩPa），其他试剂均为分析纯。星裂硬皮马勃采于吉林省德惠市朱城子乡杨树林下，由长春中医药大学王淑敏教授鉴定。

2 实验方法与结果

2.1 星裂硬皮马勃的鉴别

2．1．1 性状鉴别

子实体类球形，直径4 cm～12 cm。基部紧缩成一小的柄状基部。包被浅黄色至浅土黄色，坚硬，似革质，干后厚约1 mm～2 mm，表面有龟裂纹或鳞片，成熟时星状开裂，裂片反卷。孢体暗褐色，粉性，质轻。生长在林中树下，外生菌根菌，可与杨、桉、马尾松等树形成菌根[1-2]（图1～图2）。

2．1．2 显微鉴别

孢子球形，暗褐色，具短孢子柄，壁有凹陷窝，呈现不规则的网孔，直径6．5 μm～12 μm[1-2]。扫描电镜特征见图3～图4。

图1 星裂硬皮马勃子实体幼嫩期Fig．1 Tender period of Scleroderma polyrhizum sporophore

图2 星裂硬皮马勃子实体成熟期Fig．2 Maturation period of Scleroderma polyrhizum sporophore

图3 星裂硬皮马勃菌丝和孢子（×500）Fig．3 Spore and mycelium of Scleroderma polyrhizum(×500)

图4 星裂硬皮马勃孢子（×5 000）Fig．4 Spore of Scleroderma polyrhizum(×5 000)

2．1．3 薄层鉴别

取星裂硬皮马勃孢子1 g，加二氯甲烷40 mL，回流提取1 h，过滤，滤液挥发干燥，残渣加二氯甲烷1 mL使之溶解，作为供试品溶液。另取麦角甾醇对照品2 mg，加入2 mL二氯甲烷溶解，作为对照品溶液。按照薄层色谱法进行试验，吸取上述2种溶液各5 μL，分别点于同一硅胶G薄层板上，置以石油醚（60℃～90℃）-乙酸乙酯-甲酸（7∶4∶0．3）为展开剂的展开缸内饱和20 min，展开，取出，晾干，置紫外灯（365 nm）下检视，供试品色谱中，有如图5所示的专属性荧光斑点[3]。喷以10%磷钼酸乙醇溶液，在105℃加热至斑点显色清晰。供试品色谱中，在与对照品色谱相应的位置上，显示相同颜色的斑点，并显示如图6所示的其它专属性斑点。

图5 星裂硬皮马勃薄层色谱荧光图（1、3为孢子，2、4为麦角甾醇）Fig．5 TLC fluorescent of Scleroderma polyrhizum(1，3：spore,2，4：ergosterol)

图6 星裂硬皮马勃薄层色谱图（1、3为孢子，2、4为麦角甾醇）Fig．6 TLC of Scleroderma polyrhizum (1，3：spore，2，4：ergosterol)

2.2 星裂硬皮马勃化学成分测定

2．2．1 麦角甾醇含量的测定

（1） 对照品溶液的制备

精密称取麦角甾醇对照品5 mg，置50 mL容量瓶中，加甲醇溶解，定容，即得（0．1 mg·mL-1）。

（2）供试品溶液的制备

准确称取星裂硬皮马勃孢子0．5 g，置干燥具塞的三角瓶中，加入10 mL甲醇，精密称定重量，超声提取1 h，放至室温，称重，补加甲醇至原重量，过滤，取滤液过0．45 μm滤膜，即得供试品溶液，备用。

（3）色谱条件

汉邦ODS-C18色谱柱（4．6 mm×250 mm，5 μm），流动相为甲醇，检测波长282 nm，流速1．0 mL·min-1，柱温30℃，进样量10 μL[4-6]。理论塔板数以麦角甾醇峰计，不得少于3 000。色谱图见图7、图8。

图7 麦角甾醇标准品HPLC图Fig．7 HPLC of the ergosterol standard sample

图8 星裂硬皮马勃孢子HPLC图Fig．8 HPLC of the Scleroderma polyrhizum spore

（4）标准曲线的建立

分别精密吸取对照品溶液2 μL、4 μL、6 μL、8 μL、10 μL、12 μL、14 μL，注入液相色谱仪，测定吸收峰面积分别为：217 449、487 105、748 580、1 002 171、1 268 122、1 527 775、1 783 282。以麦角甾醇质量为横坐标，色谱峰面积为纵坐标，绘制标准曲线，计算回归方程为：Y=130 328X-37 700，r=1，麦角甾醇在0．2000 μg～1．4000 μg范围内具有良好的线性关系。

（5）样品中麦角甾醇含量测定

取供试品溶液，按2．2．2（3）项下色谱条件进样测定，计算样品中麦角甾醇的含量，结果孢子中麦角甾醇含量为0.18%。

2.2.2 甘露醇含量的测定

（1）对照品溶液的制备

精密称取甘露醇对照品3 mg，置于2 mL容量瓶中，加超纯水溶解，定容，即得（1.565 mg·mL-1）。

（2）供试品溶液的制备

准确称取星裂硬皮马勃孢子0.1 g，加水5 mL，精密称重，超声提取30 min，放至室温后称重，加水补足减失重量，摇匀，2 000 r·min-1离心10 min，上清液过0.45 μm滤膜，即得供试品溶液。

（3）色谱条件

色谱柱为SUGAR SC1011柱（300 mm×8 mm，6 μm），流动相为超纯水，流速0.5 mL·min-1，柱温70℃，进样量10 μL[7-8]。色谱图见图9、图10。

图9 甘露醇标准品HPLC图Fig.9 HPLC of the standard sample of mannitol

图10 星裂硬皮马勃孢子HPLC图Fig.10 HPLC of the spore of Scleroderma polyrhizum

（4）甘露醇标准曲线的建立

分别精密吸取对照品溶液 4 μL、6 μL、8 μL、10 μL、12 μL，注入液相色谱仪，测定吸收峰面积。峰面积分别为102 243、154 681、205 751、258 371、311 881。以甘露醇质量为横坐标，色谱峰面积为纵坐标，绘制标准曲线，计算回归方程：Y=16 708X-2 601，r=0.9999，甘露醇在6.260 μg～18.780 μg范围内具有良好的线性关系。

（5）样品中甘露醇含量测定

取供试品溶液，按“2.2.2（3）”项下色谱条件进样测定，计算样品中甘露醇的含量，结果孢子中甘露醇含量为0.50%。

3 结论

通过星裂硬皮马勃性状鉴别、扫描电镜下孢子和菌丝特征、薄层鉴别图谱等方法，可综合鉴别星裂硬皮马勃的真伪，为其鉴别提供参考依据。薄层鉴别研究表明，星裂硬皮马勃含有麦角甾醇成分，经高效液相色谱法测定，其含量为0.18%。麦角甾醇是真菌细胞膜的重要组分，它在确保膜结构的完整性，与膜结合酶的活性，膜的流动性，细胞活力及物质运输等方面起着重要作用。麦角甾醇具有重要的生理作用，其为生产激素类药物的中间体，可用来生产可的松，具有维生素D2的作用，可作为星裂硬皮马勃质量控制的指标之一。

高效液相色谱测定甘露醇的含量为0.50%。甘露醇已经应用于治疗颅内疾病、顽固心绞痛、消化系统疾病、肝脏疾病、泌尿系统疾病、眼科疾病、顽固性超高热以及中毒时导泻等疾病，显示了甘露醇在医学领域具有广阔的应用空间[8]。星裂硬皮马勃含有较高的甘露醇，提示其可能具有更广泛的应用，为今后的研究开发指明了方向，同时也可作为星裂硬皮马勃质量控制的指标之一。

[1]卯晓岚.中国大型真菌[M].郑州：河南科学技术出版社，2000：543.

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[5]张丽，王瑜杰，丁安伟.HPLC法测定灵芝孢子油中麦角甾醇的含量[J].江苏中医药，2009，41（6）：52-53.

[6]谷学新，赵红帅，邹洪，等.高效液相色谱法测定功能性红曲米粉中的麦角甾醇[J].现代科学仪器，2006（1）：78-79.

[7]田贞乐，徐春花.HPLC-RID法测定虫草菌丝体中甘露醇[J].食用菌学报，2010（增刊）：113-115.

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Research on Pharmacognostics of Medicinal Fungi Scleroderma polyrhizum Pers.

WANG Da-ke1,GONG Shi-lin2,XU Li-ting1,ZHOU Xian1,WANG Shu-min1
(1．Pharmaceutical College of Changchun University of Traditional Chinese Medicine,Jilin 130117,China; 2．Pharmaceutical College of China Pharmaceutical University,College of Pharmacy,Nanjing 210009,China)

The pharmacognostics of medicinal fungi Scleroderma polyrhizum Pers．were studied,which provided a identifying basis for the development and application．The sporophore of S.polyrhizum was collected so that its species was identified by researching morphological of microscopic characteristics of spore and mycelium as well as literature．TLC was used to establish the specificity of S.polyrhizum,and its chemical composition content were determined by HPLC．The collected S.polyrhizum was identified as the medicinal fungi puffballs,after the study of characters and microscopic characteristics．A plurality of specific TLC spots were found in TLC study,including ergosterol．The ergosterol content were determined of 0．18%using HPLC method and the content of mannitol was 0．5%in S.polyrhizum．We can identify comprehensively the authenticity of S.polyrhizum through the identification of characters,observing the characteristics of spore and mycelium by optical microscope and scanning electron microscope and TLC atlas,it provided the referenced evidence for the identification of S.polyrhizum．The content of ergosterol and mannitol can be selected as an important indicator for quality control in S.polyrhizum,and provided scientific data for its development and utilization in the future．

Scleroderma polyrhizum Pers．;pharmacognostics;ergosterol;mannitol

S646.9

A

1003-8310（2015）06-0050-04

10．13629/j．cnki．53-1054．2015．06．013

国家自然科学基金项目（81274037）；吉林省教育厅项目 (吉教科合字 [2013]第85号)。

王大可（1988-），男，在读硕士研究生，研究方向为中药学。E-mail:821751904@qq．com

**通信作者：王淑敏（1965-），女，博士，教授，主要从事中药分析学及微生物与生化药物方面研究。E-mail:446097156@qq．com

2015-09-07