黔产石韦提取物对小鼠外周血白细胞数的影响

龙 毅，袁吉虎，许杨珊，杨武德

（贵阳中医学院，贵州 贵阳550002）

石韦为蕨类植物水龙骨科植物石韦〔Pyrrosia lingua（Thunb．）Farwell〕的全草，别名有柄石韦、刀尖药、石茶叶，其性甘味苦，微寒，归肺、膀胱经，具有清肺泄热、利水通淋、清热止血之功效。主要用于淋病、小便不通、出血及肺热喘咳，属利水渗湿药［1］。研究发现，石韦对因化疗及放疗引起的白血球减少症状有明显的升白作用［2］。梅志洁等［3］将小鼠随机分成CTX（环磷酰胺）组、CTX 加石韦大枣小剂量组、CTX 加石韦大枣中剂量组、CTX 加石韦大枣大剂量组，分别用生理盐水和石韦大枣合剂不同剂量连续灌喂，连续观察对试验小鼠白细胞、非特异性免疫功能和粒－单系集落形成单位（CFU－GM）的影响，结果显示，环磷酰胺加石韦大枣合剂大剂量、中剂量组白细胞下降程度明显低于单纯环磷酰胺组（P＜0．05），石韦大枣合剂能显著对抗CTX 导致的非特异性免疫功能和粒－单系集落形成单位减少。表明，石韦大枣合剂能明显增强单核－巨噬细胞系统功能，提高机体免疫能力，对人体无毒副作用，能明显对抗环磷酰胺所致的白细胞减少。石韦在贵州应用广泛，是贵州各民族常用药，黔产石韦有明显的地区特色和药用价值，研究黔产石韦的升白作用有显著的经济意义及科学价值。因此，笔者所在研究组进行了有柄石韦的不同极性部位萃取物对小鼠白细胞影响的研究。中药的水溶液中通常含有氨基酸［4－5］，氨基酸对于人体营养有极其重要的作用，具有调节人体生理机能、增强免疫力的功效。谷氨酸在医学上主要用于治疗肝性昏迷，甘氨酸可用作医学微生物和生物化学氨基酸代谢研究的用药以及金霉素缓冲剂、抗帕金森氏病药物L－多巴、维生素B6以及苏氨酸等氨基酸的合成原料。丙氨酸可预防肾结石、协助葡萄糖代谢，有助缓和低血糖，改善身体能量。亮氨酸可配制氨基酸输液及综合氨基酸制剂，可作降血糖剂及植物生长促进剂。公认的具有显著升白效果的中成药——阿胶中就含高达18 种氨基酸成分［6］。植物氨基酸提高白细胞数的作用也早有研究证实［7］。笔 者 等 采 用PITC 作 为 衍 生 试 剂［8］，采 用RP－HPLC梯度洗脱法同时对石韦中氨基酸进行分析，以期为黔产石韦提高白细胞数的进一步研究提供理论依据。

1 材料与方法

1．1 材料

1．1．1 仪器 高效液相色谱仪（日本岛津／lC－20AT），色 谱 柱 为 Welchrom C18 （250 mm×4．6mm，5μm），粉碎机（天津市泰斯特仪器有限公司），光学显微镜（CKX－41，OLYMPUS）。

1．1．2 药材 小鼠外周血白细胞数对比试验所用药材采自贵州凯里市雷山县，鉴定为石韦属水龙骨科蕨类植物石韦全草。氨基酸成分分析试验所用石韦药材粉末购自贵州百灵制药厂。氨基酸对照品（中国药品生物制品检定所提供，批号：100080－200707，包括Leu，Glu，Gly，Ala），PITC（纯度标示量为99%），购自贵州银华科技有限公司，其他试剂均为分析纯。

1．1．3 小白鼠 昆明种，体重18～22g，雌雄各半，清洁级。由贵阳医学院提供，合格证号：SCXK（黔）2002－001。

1．2 黔产石韦不同极性部位萃取物的制备

将所有采集的石韦全株阴干后除去杂质并粉碎成粗粉备用。

1）醇提物。将有柄石韦的粗粉用75%乙醇提取3次，合并提取液，水浴60℃挥发，得流浸膏，提物备用。

2）水提物。将药材醇提后的药渣阴干，于温度约70℃热水中煎煮3 次，合并滤液至蒸发皿中蒸干，放入干燥箱内干燥，备用。

3）石油醚部位。将醇提物流浸膏用温水（温度约为40℃）溶解，用石油醚重复萃取至无色即可，合并液，浓缩，置水浴锅上蒸干，备用。

4）乙酸乙酯部位。将石油醚萃取后的水溶液于水浴锅上挥发掉残余的石油醚后，用乙酸乙酯萃取剩余溶液，合并液，浓缩，干燥备用。

5）正丁醇部位。将乙酸乙酯萃取后的水溶液于水浴锅上挥发掉残余的乙酸乙酯后，用正丁醇萃取，合并液，浓缩，干燥备用。

6）剩余部位。将正丁醇萃取完成后的剩余部位转至蒸发皿中，置于水浴锅上浓缩，待全部水分蒸干后放进干燥箱内干燥后备用。

1．3 黔产石韦提取物对小鼠外周血白细胞数的影响

取小白鼠140只，雌雄各半，随机分为14组，分别为空白对照组、阳性对照组（灌胃阿胶，3g／kg）和给药组（分别为醇提物大剂量组、小剂量组，水提物大剂量组、小剂量组，石油醚萃取物大剂量组、小剂量组，乙酸乙酯萃取物大剂量组、小剂量组，正丁醇萃取物大剂量组、小剂量组，剩余部位大剂量组、小剂量组；以上各组剂量分别为7g／kg、2．0g／kg，

7g／kg、2．0g／kg，1．0g／kg、0．3g／kg，0．9g／k、0．3g／kg，1．8 g／kg、0．6 g／kg 和3．3 g／kg、1．1g／kg）。分别对各组小白鼠进行断尾取血40μL，加入盛有280μL白细胞稀释液的具塞离心管中，摇均，静置。取10μL，滴于白细胞计数板，光学显微镜低倍镜下观察，记录计数板上第二象限和第四象限上的白细胞数，以两次计数的平均值表示小鼠外周血白细胞数基础值。取血后第2天开始给药，空白对照组以0．1mL／10g灌胃生理盐水，阳性组以0．3g／mL的阿胶混悬液按0．1mL／10g灌胃给药，给药组按相应剂量以0．1mL／10g灌胃给药，连续10d，每天1次。第11天分别对各组小白鼠进行白细胞测定，方法同上。记录白细胞数。

1．4 黔产石韦氨基酸成分分析

1） 色谱条件。色谱柱为 Welchrom C18（250mm×4．6mm，5μm），流动相A 为0．1mol／L的醋酸钠缓冲液（以醋酸钠pH6．5）－乙腈（93∶7），流动相B为乙腈－水（4∶1），检测波长为254nm，柱温为30℃，流速为1．0mL／min，进样量为5μL，进行梯度洗脱。

2）对照品溶液的制备及标准曲线的绘制。取4种氨基酸适量，精密称定，加入0．1mol／L盐酸溶液制成每1mL分别含谷氨酸（Glu）0．123mg、甘氨酸（Gly）0．079 2 mg、丙氨酸（Ala）0．065 mg、亮氨酸（Leu）0．072mg溶液，即得对照品储备液。分别吸取氨基酸对照品储备液1mL、2mL、3mL、5mL和10 mL，分别置25 mL 量瓶中，加入0．1 mol／L PITC－乙腈溶液及1 mol／L 三乙胺－乙腈溶液至刻度，混匀。取溶液10mL，加入正己烷15mL，放置20min，取下层溶液，微孔滤膜（0．45μm）过滤，得系列浓度溶液，按上述色谱条件进样色谱检测，测定峰面积。分别以氨基酸对照品峰面积y 为纵坐标，4种氨基酸对照品浓度x（μg／mL）为横坐标，绘制工作曲线，计算回归方程。

3）供试品溶液的制备。称取研匀后样品粉末0．6g，精密称定，置安瓿瓶中，加入水解液（含0．5%苯酚的50%盐酸溶液）10mL，熔封安瓿，用纱布包裹，于150℃水解1h，放冷，过滤，并用水清洗滤渣，合并滤液和洗液于蒸发皿中，蒸干，残渣用0．1mol／L盐酸溶液15mL 分3次溶解洗涤并转移至25mL 容量瓶中，加入0．1mol／L PITC－乙腈溶液［9］及mol／L三乙胺－乙腈溶液各2．5mL，混匀，室温放置1 h，加50% 乙腈溶液至刻度。取溶液10mL，加入正己烷15mL，放置20 min，取下层溶液，微孔滤膜（0．45μm）过滤即得。

4）样品含量测定。取供试品溶液5 mL，置于25mL 量瓶中，加入0．1mol／L PITC－乙腈溶液及1mol／L三乙胺－乙腈溶液至刻度，混匀。取溶液10mL，加入正己烷15 mL，放置20 min，取下层溶液，微孔滤膜（0．45μm）过滤所得溶液，按上述色谱条件进样色谱条件，测定峰面积，对应标准曲线读取相应浓度。

1．5 数据分析

采用Excel 2003进行数据整理与分析。

2 结果与分析

2．1 不同极性部位的萃取率

由表1可知，不同极性部位的萃取率差异不大。其中，萃取后剩余部位的萃取率最高，达4．73%；正丁醇部位其次，为2．51%；石油醚部位和乙酸乙酯部位的萃取率较低，分别为1．53%和1．36。

2．2 不同极性部位萃取物对小鼠外周血白细胞数的影响

由表2可知，与空白对照组比较，阳性对照组能明显提高小鼠外周血白细胞数；水提物大剂量组、小剂量组，醇提物大剂量组、小剂量组，正丁醇大剂量组、小剂量组和剩余部位大剂量组、小剂量组均能明显提高小鼠外周血白细胞数。其中，阳性对照组、水提物大剂量组、水提物小剂量组、醇提物大剂量组、正丁醇大剂量组、正丁醇小剂量组和剩余部位大剂量组达0．001显著水平；醇提物小剂量组和剩余部位小剂量组达0．01显著水平。石油醚大剂量组、小剂量组、乙酸乙酯大剂量组和小剂量组对小鼠外周血白细胞数无明显影响。其中，水提取物的效果最明显。

表1 黔产石韦不同提取部位的萃取率Table 1 Extraction rate of different parts of P．petiolosa

表2 黔产石韦各极性萃取物给药后小鼠外周血白细胞数Table 2 White cell count in peripheral blood of mice injected with extracts with different polarity

表3 黔产石韦中4种氨基酸的含量Table 3 Contents of four kinds of amino acids inP．petiolosa

2．3 黔产石韦氨基酸成分

目前，较少有涉及石韦中氨基酸的成分及含量的研究，本研究表明，黔产石韦中至少含有4种氨基酸，其对应的含量见表3，各种氨基酸含量顺序为谷氨酸＞甘氨酸＞丙氨酸＞亮氨酸，这与刘恒霞等在5种蕨类植物中发现的氨基酸含量顺序［10］基本吻合。这4种氨基酸中，谷氨酸的含量最高，因此可以推测，谷氨酸是黔产石韦水提取物提高小鼠外周血白细胞数的关键成分。但与刘恒霞等在其他蕨类植物中的发现不同，黔产石韦中的甘氨酸含量几乎是丙氨酸或亮氨酸含量的两倍。这一特殊现象说明，甘氨酸很可能对提高小鼠外周血白细胞数起协同作用。

3 结论与讨论

本研究采用溶剂法提取了黔产石韦的不同极性化学部位，并通过常规白细胞计数法评价了不同极性化学部位对小鼠外周血白细胞数的影响。结果发现，黔产石韦水提部位、醇提部位、正丁醇部位、剩余部位这些极性较大部位均对小鼠外周血白细胞数有明显升高作用，而石油醚、乙酸乙酯部位这两个极性较小部位没有明显升白效果，其中，水提组分升白效果最为显著。参考过去的研究工作，氨基酸组分被猜测为水提部位中主要起升白效果的成分，因此本研究组尝试应用标准品对照的HPLC 方法定量分析黔产石韦中氨基酸成分组成及含量，结果发现，黔产石韦中至少含有谷氨酸、甘氨酸、丙氨酸和亮氨酸4种氨基酸。4 种氨基酸的相对标准偏差均小于3．0%。其中以谷氨酸含量最高。

居霞筠研究组的工作显示［11］，谷氨酸的锂盐具有明显的升高小鼠外周血中白细胞数量的作用，除了锂离子的升白作用外，很可能谷氨酸根离子也参与了作用。因此，结合本研究结果，推测谷氨酸是黔产石韦水提取物中起到升白效果的关键成分。此外，本研究还发现，甘氨酸含量几乎是丙氨酸或亮氨酸含量的两倍，这与过去在其他的蕨类植物中发现的3种氨基酸含量接近的结果有明显区别。过去的研究发现甘氨酸具有细胞保护的作用［12］。在黔产石韦的升白过程中，很可能谷氨酸和甘氨酸均有参与。谷氨酸刺激新的白细胞生成，而甘氨酸则保护已有的白细胞不被机体或外来物质破坏而发生凋亡，即黔产石韦的升白效果是谷氨酸和甘氨酸2种氨基酸的协同作用。

与过去的研究相比，本研究明确了黔产有柄石韦的各极性组分升白效果的区别，推测药物分子极性很可能会影响药材的升白效果，并且详细研究了黔产石韦的氨基酸成分，推断了谷氨酸对于黔产石韦升白效果的关键作用。对黔产石韦升白效果的进一步研究提供了理论依据。

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