独活寄生汤对腰椎间盘突出症小鼠纤维化坏死MMP-1表达的影响

张立庄

(河北医科大学第一医院康复医学科，石家庄 050031)

独活寄生汤对腰椎间盘突出症小鼠纤维化坏死MMP-1表达的影响

张立庄

(河北医科大学第一医院康复医学科，石家庄 050031)

目的:旨在观测腰椎间盘突出症小鼠灌服独活寄生汤后体内MMP-1含量变化，研究独活寄生汤对腰椎间盘突出症患者MMP-1的影响。方法:建立腰椎间盘突出症小鼠模型，按随机数字表法分为对照组、模型组、独活寄生汤组和扶他林组各12只。观察椎间盘组织形态学变化，检测椎间盘局部及血清中MMP-1含量变化。结果:造模成功后，B组小鼠椎间盘局部组织和血浆中MMP-1含量较A组显著增加;灌胃扶他林和独活寄生汤后，C组小鼠椎间盘局部组织和血浆中MMP-1含量显著降低;D组小鼠椎间盘局部组织和血浆中MMP-1含量亦显著降低;C组与D组比较，C组小鼠椎间盘局部组织和血浆中MMP-1含量低于D组小鼠，表明独活寄生汤治疗腰椎间盘突出症更具疗效。结论:腰椎间盘突出髓核组织和纤维环组织中MMP-1表达增加，在椎间盘退变突出中发挥重要作用。独活寄生汤可有效调控MMP-1的表达从而发挥治疗作用。

独活寄生汤;腰椎间盘突出;MMP-1

随着人口老龄化问题的日渐加剧，腰椎间盘突出症的发病率亦呈逐年上升趋势，严重影响患者的生活质量，给患者和家庭带来严重的经济负担［1］。腰椎间盘突出症病程反复，发病率高［2］。近年来研究显示，独活寄生汤是中医药治疗本症的常用方，具有镇痛、抗炎、改善血液循环等作用［3］。本研究旨在观测腰椎间盘突出症模型小鼠经灌服独活寄生汤后体内MMP-1的含量变化，为其临床治疗提供依据。

1 材料与方法

1.1 主要仪器和试剂

MMP-1检测试剂盒(南京建成生物工程研究所，南京)，高速离心机(上海医用分析仪器厂，上海)，切片机(MICROM公司，德国)，光学显微镜(Nikon公司，日本)。

1.2 实验动物

48只健康 C57小鼠，8周龄，体质量22.5～24.5 g，雌雄各半。本组研究动物由北京维通利华实验动物技术有限公司提供。

1.3 药物

扶他林(双氯芬酸钠缓释片，北京诺华制药有限公司生产)，独活寄生汤超微颗粒组成:独活12 g，秦艽9 g，桑寄生9 g，牛膝9 g，杜仲9 g，细辛9 g，干地黄6 g，防风6 g，茯苓6 g，当归6 g，川芎6 g，肉桂心6 g，芍药6 g，人参6 g，甘草3 g。

1.4 方法

1.4.1 动物分组 48只小鼠按照随机数字表法分为对照组(A组)、模型组(B组)、独活寄生汤组(C组)、扶他林组(D组)4组各12只。

1.4.2 造模方法 小鼠称重、麻醉、固定后，以腰6-7间隙为中心，从左下腹部旁正中切开皮肤，暴露腰L6-7椎体前部位，分开椎前肌肉，采用自制造模器造模。于L6-7椎间隙取45°斜径位，使用穿刺针刺破前纤维环及前纵韧带，再将穿刺针管向右后旋转推进，固定针管，将平头内芯插入针管并推进，将针管内的椎间盘组织完全推出到针管外，造成L6-7椎间盘右侧突出模型。

1.4.3 给药方法 48只小鼠适应性饲养1周，采取标本后分别对各组小鼠进行造模，成功存活1周后开始灌胃。独活寄生汤组给予灌服独活寄生汤超微颗粒，剂量为13.8 mg/kg。扶他林组给予灌服伏他林，剂量为2.3 mg/kg。模型组给予灌服等容生理盐水，每日2次，连续2周，对照组不予特殊处理。

1.5 指标检测

1.5.1 血浆标本采集 所有小鼠经1%戊巴比妥钠(3 ml/kg)麻醉后取材，每只小鼠抽取全血2 ml，经3000 rpm/min离心10 min后取上清，－80℃保存待用。

1.5.2 L6-9椎间盘髓核组织标本采集 A组和B组小鼠处死采集局部组织标本，C组和D组小鼠在灌胃2周后处死取材。标本冲洗后分析天平称重，并按照2 ml/400 mg加入生理盐水，玻璃匀浆器制成髓核组织匀浆，经4000 rpm/min离心10 min后取上清液，－80℃保存待用。

1.5.3 主要观察指标 ELISA法检测椎间盘髓核组织和血浆中MMP-1含量，Western blot法检测MMP-1蛋白表达，HE染色观察髓核的病理变化情况。

1.6 统计学方法

应用SPSS 17.0软件进行统计分析，所得数据以均数±标准差(±s)表示，P＜0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 组织形态结果

图1显示，造模成功后，腰椎间盘突出症小鼠髓核中可见新生血管、肉芽组织、纤维环出现裂隙，甚至纤维化正常结构消失，髓核出现皱缩，髓核内细胞减少。C组和D组小鼠给予独活寄生汤和扶他林灌胃后，局部炎性细胞浸润明显减轻。

图2显示，Western blot检测结果显示，MMP-1分子量约为65kDa。4组小鼠MMP-1蛋白检测可见，造模后MMP-1蛋白表达增加，灌服独活寄生汤和扶他林后，MMP-1蛋白表达降低。

图1 免疫组化分析结果

图2 Western Blot分析结果

2.2 突出椎间盘局部MMP-1的含量变化

表1显示，造模成功后，B组小鼠椎间盘局部组织中MMP-1含量较A组显著增加，具有统计学意义。灌胃扶他林和独活寄生汤后，C组小鼠椎间盘局部组织中MMP-1含量显著降低，D组小鼠椎间盘局部组织中MMP-1含量亦显著降低。C组与D组比较，C组小鼠椎间盘局部组织中MMP-1含量低于D组小鼠，表明独活寄生汤治疗腰椎间盘突出症更具疗效。

表1 不同组别腰椎间盘突出小鼠椎间盘局部MMP-1含量变化(±s)

表1 不同组别腰椎间盘突出小鼠椎间盘局部MMP-1含量变化(±s)

注:与对照组比较:*P＜0.05，表明造模成功;与模型组比较:#P＜0.05;与扶他林组比较:＆P＜0.05

组别 造模成功后 灌服药物后对 照 组 8.35±2.36 8.17±2.19模 型 组 16.68±4.67* 15.79±4.63独活寄生汤组 16.42±4.38* 10.11±3.17#＆扶 他 林 组 16.69±4.71* 12.36±3.92#

2.3 外周血浆中MMP-1的含量变化

表2显示，造模成功后，B组小鼠血浆内MMP-1含量较A组显著增加，具有统计学意义。灌胃扶他林和独活寄生汤后，C组小鼠血浆内MMP-1含量显著降低，D组小鼠血浆内MMP-1含量亦显著降低。C组与D组比较，C组小鼠血浆内MMP-1含量低于D组小鼠，表明独活寄生汤治疗腰椎间盘突出症更具疗效。

表2 不同组别腰椎间盘突出小鼠血浆内MMP-1含量变化(±s)

表2 不同组别腰椎间盘突出小鼠血浆内MMP-1含量变化(±s)

注:与对照组比较:*P＜0.05，表明造模成功;与模型组比较:#P＜0.05;与扶他林组比较:＆P＜0.05

组别 造模成功后 灌服药物后对 照 组 10.48±2.36 9.67±2.19模 型 组 29.15±4.67* 28.35±4.63独活寄生汤组 30.14±4.38* 14.11±3.17#＆扶 他 林 组 30.78±4.71* 19.47±3.92#

3 讨论

腰椎间盘突出症属于中医“痹症”范畴，多与风、寒、湿、虚相关，而人体内在的正虚是疾病发病的关键［4-5］。该病以中老年患者为主，因为该人群正是正气虚衰之际。腰椎间盘突出根据其临床表现的不同可分为肝肾亏虚型、风寒湿型、气滞血瘀型3种类型。寒湿证给予祛湿止痛、温经散寒，血瘀证给予祛瘀通络、舒筋活络，湿热证给予祛风利湿、清热解毒［6-8］。近年来研究发现，独活寄生汤为治疗本症的基本方。

独活寄生汤载于《备急千金要方》，是治疗风寒湿痹的重要方药，具有祛风湿、止痹痛、益肝肾、补气血药等功效，主要治疗痹症日久、肝肾两虚、气血不足之症。本方为治疗久痹而肝肾两虚、气血不足之常用方。方中重用独活为君药，善治伏风、除久痹，且性善下行，主要治以祛筋骨以及下焦间的风寒湿邪;细辛、秦艽、防风、桂心入少阴肾经作为臣药，长于风寒湿邪，同时又能够祛除经络留湿;桂心温经散寒，具有通利血脉作用;秦艽具有祛风湿、舒筋络利关节之功效;防风可祛一身之风而胜湿，君药与臣药共配伍可驱风寒湿邪;桑寄生、杜仲、牛膝以补益肝肾而强壮筋骨;川芎、地黄、当归、白芍可养血和血，茯苓、人参、甘草健脾益气，与诸药共用具有益气血、补肝肾作用。此外，甘草兼使药共调和诸药。纵观全方，主要为祛风寒湿邪，辅以益气血与补肝肾之品，邪正兼顾，驱邪不伤正，扶正不留邪。

近年来研究显示，独活寄生汤治疗腰椎间盘突出症的作用机理主要包括免疫抑制、抗炎和改善微循环。正常椎间盘中未发现MMP-3、IL-1、IL-1、TNF等免疫反应性细胞因子。研究显示，LDH患者的血清MMP-3含量显著高于正常人。大量研究还证实，腰椎间盘突出常伴随炎症反应，其中PGE2被证实是众多炎症介质中的重要成分。腰椎间盘突出局部组织内的PGE2含量显著高于正常人［9］。椎间盘是脊椎骨的负重关节，随着年龄增长，椎间盘内营养成分和水分逐步减少，渐渐发生退行性变化，进而弹性降低、椎间隙变窄、椎体间过度活动等，从而导致椎间盘突出［10］。

本研究结果显示，B组小鼠造模成功后椎间盘局部组织和血浆中MMP-1含量较A组小鼠造模后显著增加。灌胃扶他林和独活寄生汤后，C组小鼠椎间盘局部组织和血浆中MMP-1含量显著降低，D组小鼠椎间盘局部组织和血浆中MMP-1含量亦显著降低。C组与D组比较，C组小鼠椎间盘局部组织和血浆中MMP-1含量低于D组小鼠，表明独活寄生汤治疗腰椎间盘突出症更具疗效。综上所述，腰椎间盘突出髓核组织和纤维环组织中MMP-1表达增加，在椎间盘退变突出中发挥重要作用。独活寄生汤可有效调控MMP-1的表达，从而发挥治疗作用。

［1］马彦旭，张翔，孟开，等．独活寄生汤治疗腰椎间盘突出症随机对照试验的系统评价［J］．中医杂志，2012，53(24): 2095-2099．

［2］章良．独活寄生汤配合针刀针刺治疗腰椎间盘突出症疗效观察［J］．新中医，2012，44(11):93-94．

［3］杨彬，李洲进，邓志，等．独活寄生汤对腰椎间盘突出症兔前列腺素 E2的影响［J］．中国组织工程研究，2012，16 (50):9407-9413．

［4］马彦旭，赵宇昊，黄明华．独活寄生汤加减治疗腰椎间盘突出症34例［J］．中国实验方剂学杂志，2011，17(15):241-243．

［5］李俊辉，张向慧，艾进伟，等．独活寄生汤加减治疗腰椎间盘突出症手术后遗症30例［J］．中医杂志，2011，52(2): 158-159．

［6］张国福，杨阳，李华南．热敏灸疗配合中药内服治疗风寒湿型腰椎间盘突出症［J］．中国实验方剂学杂志，2012，18 (7):264-266．

［7］王煜，朱文勇，张振华．60例腰椎间盘突出症患者术后MRI检查结果分析［J］．山东医药，2010，50(18):74-75．

［8］王洪伟，李长青，周跃．腰椎间盘突出症疼痛发生机制的研究进展［J］．中国矫形外科杂志，2011，19(7):568-571．

［9］张志南．传统中医药治疗方法对腰椎间盘突出症的临床症状改善分析［J］．时珍国医国药，2013，24(8):1923-1925．

［10］刘晓虹，汪珍秀．中药联合手法治疗腰椎间盘突出症46例疗效观察［J］．新中医，2013，45(7):153-154．

R285．5

B

1006-3250(2015) 02-0172-03

2014-11-16

张立庄(1980-)，男，医学本科，从事中西医结合防治脊柱病的临床与研究。