槲皮素对2型糖尿病大鼠肾脏肥大的影响机制*

王兴红，常陆林，王桂叶，刘会君

(漯河医学高等专科学校基础医学部，河南漯河 462000)

槲皮素对2型糖尿病大鼠肾脏肥大的影响机制*

王兴红，常陆林，王桂叶，刘会君

(漯河医学高等专科学校基础医学部，河南漯河 462000)

目的:观察槲皮素对2型糖尿病大鼠肾脏肥大的影响并探讨其作用机制。方法:建立2型糖尿病大鼠模型，按随机数字表法分为正常对照组、糖尿病模型组以及槲皮素组，测定各组大鼠血糖、血脂、总胆固醇、血清胰岛素、胰岛素敏感指数(ISI)、肾脏肥大指数和单根近端小管(PT)钠钾ATP酶(Na+，K+-ATPase)活性，免疫组化法测定肾脏Toll样受体4(TLR4)蛋白表达。结果:与模型组比较，槲皮素组大鼠血糖、血脂、总胆固醇、血清胰岛素水平、肾脏肥大指数、Na+，K+-ATPase活性和肾内TLR4蛋白表达显著降低，差异均有统计学意义。结论:槲皮素能抑制2型糖尿病大鼠肾脏肥大，其机制可能与降低血糖、血脂、总胆固醇和肾脏TLR4蛋白表达，升高ISI及稳定Na+，K+-ATPase活性有关。

2型糖尿病;槲皮素;肾脏肥大;Toll样受体4;钠钾ATP酶

目前我国2型糖尿病(type 2 diabetes mellitus，T2DM)发病率呈逐年递增趋势，故遴选有效、毒副作用小的中药用于T2DM防治具有重要的临床价值。槲皮素(Quercetin，Que)是一种天然的黄酮类化合物，因其具有广泛的药理作用，愈来愈受到人们的重视，它是具有多靶点作用和综合治疗优势的中药单体。研究表明［1］，Que对大鼠慢性肾功能衰竭具有防治作用，但机制尚未明确。课题组前期研究显示［2］，Que可以抑制糖尿病大鼠肾脏肥大并保护肾功能。为进一步揭示其机制，本研究腹腔注射Que，观察肾脏Toll样受体4(TLR4)的蛋白表达、近端小管(PT)的钠钾ATP酶(Na+，K+-ATPase)活性、胰岛素敏感指标数(insulin sensitivity index，ISI)等变化，为临床应用Que提供理论依据。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 动物与饲料 30只成年健康雄性SD清洁级大鼠，体质量300～350 g，由河南省实验动物中心提供(合格证号410117)，饲养环境符合医学实验动物环境设施要求。基础饲料:57%碳水化合物，22%蛋白质，6%脂肪，8%纤维素，7%其他成分。高能饲料:60%基础饲料，20%蔗糖，20%猪油，由河南省实验动物中心提供。

1.1.2 药物和试剂 槲皮素(批号100123，Sigma公司)，链脲佐菌素(批号090412，Sigma公司)，TLR4小鼠抗大鼠单克隆抗体(批号110812，美国Santa Cruz公司)，总胆固醇、甘油三酯检测试剂盒(批号090311、090406，南京建成生物公司)，胰岛素放射免疫检测试剂盒(批号090621，北京北方生物技术研究所)，Na2ATP、哇巴因(ouabain，Sigma公司)，胶原酶II、EGTA(Gibco公司)，［γ-32P］ATP(北京福瑞特公司)。

1.1.3 主要仪器 三诺SXT-1型快速血糖测定仪(长沙)，SN-6930A型液闪仪与SN-6100型γ计数器(上海核所日环光电公司)，CM1900-1-1恒冷箱冰冻切片机(德国 Leica)，倒置光显微镜(德国Leica)，UV7501紫外分光光度计(无锡科达仪器厂)，MiVnt显微生物图像分析系统(北京瑞宏诚科技发展有限公司)。

1.2 方法

1.2.1 模型建立、分组与给药 成年健康雄性SD大鼠适应性喂养1周后，参照王保伟［3］等方法建立T2DM大鼠模型，随机血糖≥16.65 mmol/L为糖尿病大鼠。大鼠按随机数字表法分为正常对照组、糖尿病模型组和槲皮素组(50 mg/kg·d，临用前用生理盐水配成含槲皮素10 g/L的溶液)灌胃治疗8周。正常组和糖尿病模型组按体质量换算等体积生理盐水灌胃8周。在实验过程中模型组2只大鼠因高血糖死亡，最终28只完成实验，其中正常对照组10只，模型组8只，槲皮素组10只。

1.2.2 标本采集与处理 实验动物于槲皮素治疗8周末空腹12 h，心脏采血离心后－70℃保存备用;处死大鼠剖腹取双肾，去包膜、称重、计算肾脏肥大指数(肾脏肥大指数 =双侧肾质量/体质量×%)。右肾用于PT的钠钾ATP酶活性测定，左肾固定、石蜡包埋做4μm厚度非连续切片，进行免疫组化染色。

1.2.3 生化和放免检测 空腹血糖(FBG)快速血糖仪测定;甘油三酯(TG)、总胆固醇(TC)均采用紫外分光光度计测定;胰岛素水平(FINS)采用放射免疫分析法测定并计算胰岛素敏感指数(IsI)［4］。以上项目均由漯河市中心医院检验科测定。

1.2.4 Na+，K+-ATPase活性测定 显微镜下挑取各组PT，参照沈东波等改良的方法［5］测定PT管周膜Na+，K+-ATPase活性。Na+，K+-ATPase活性(μmol/g/h)=(X-B)/蛋白浓度×样本体积×孵育时间(h)×SRA。X为待测样本的液体闪烁计数值，B为空白对照管的液体闪烁计数值，SRA为［γ-32P］ATP的比活性。

1.2.5 免疫组化SP法检测肾脏TLR4蛋白表达 取肾组织切片烤片，常规脱蜡至水、抗原微波热修复、山羊血清液封闭;滴加TLR4一抗(1∶100稀释)，4。C孵育1 h，滴加抗小鼠生物素化二抗孵育10 min，滴加HRP标记链亲和素孵育10 min，滴加DAB显色，苏木素复染、梯度酒精脱水、二甲苯透明、封片，显微镜观察。TLR4蛋白表达以细胞或结构周围不同程度的棕黄色为阳性。根据免疫组化染色结果，观察各组大鼠肾TLR4的定位和表达。每只大鼠观察4张切片，每张切片于400倍镜下随机选取不重复的5个阳性视野，观察阳性染色部位并采集图像后结合IMAGE J软件，分析求得平均光密度值(IOD)。

1.2.6 统计学方法 应用SPSS 13.0统计软件进行统计分析，计量资料以均数±标准差(±s)表示，各组间比较采用单因素方差分析，P＜0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 一般情况

与正常对照组比较，糖尿病模型大鼠出现多饮、多尿、多食等症状，毛发色泽黯淡，精神萎靡，活动减少，随着病程延长，除大鼠体质量呈下降趋势外，其他症状更加明显;与糖尿病模型组比较，槲皮素治疗8周后上述症状体征得到改善。

2.2 血清生化指标和肾脏肥大指数

表1显示，与正常对照组比较，糖尿病模型大鼠TC、TG、FBG、肾脏肥大指数显著升高(P＜0.05或P ＜0.01);与模型组比较，槲皮素组大鼠 TC、TG、FBG、肾脏肥大指数显著降低(P＜0.05或 P＜0.01)。

表1 药物干预8周不同组别TC、TG、FBG、肾脏肥大指数比较

2.3 血清 FINS、IsI和 PT管周膜 Na+，K+-ATPase活性

与正常对照组比较，糖尿病模型大鼠FINS水平、Na+，K+-ATPase活性显著升高，IsI显著降低(P＜0.05或P＜0.01);与糖尿病模型组比较，槲皮素组大鼠FINS水平、Na+，K+-ATPase活性显著降低，ISI显著升高(P＜0.05或P＜0.01)。

表2 药物干预8周不同组别血清FINS、IsI和Na+，K+-ATPase活性

2.4 免疫组化SP法检测肾脏TLR4蛋白表达图1、表2显示，与正常对照组比较，糖尿病模型大鼠肾脏TLR4蛋白表达显著升高(P＜0.01);与模型组比较，槲皮素组大鼠肾脏TLR4蛋白表达显著显著降低(P＜0.01)。

图1 各组大鼠肾脏TLR4蛋白表达的变化(免疫组化SP法 ×400)

3 讨论

2型糖尿病(T2DM)是一种慢性、全身代谢性疾病，表现为胰岛素分泌相对不足或胰岛素抵抗、高血糖及血脂紊乱等。根据T2DM发病机制，本实验选用雄性SD大鼠高脂喂养4周，腹腔一次性注射STZ 45 mg/kg诱导胰岛素抵抗，大鼠出现高血糖、高TC、高TG和胰岛素敏感性(ISI)下降，同时伴有多饮、多尿、多食等症状，类似临床T2DM病人“三多一少”症状，提示糖尿病模型制备成功。而经Que治疗8周后，大鼠血清FBG、TC、TG得到明显改善，ISI显著升高，“三多一少”症状也得到一定程度改善，提示Que对T2DM具有一定的治疗作用。

Toll样受体(toll-like receptor，TLR)是细胞内外信息传递并引发炎症反应的关键跨膜蛋白［6］。TLR4是TLRs家族中最重要的成员，可以介导多种炎症及急性期反应的细胞因子形成，其在糖尿病肾病(DN)发生发展中的作用备受关注。王建平等［7］的研究证实，糖尿病大鼠肾脏TLR4表达明显上调，并参与DN的进展。本研究也显示，模型大鼠肾脏TLR4表达明显增加，而经过Que治疗后明显降低且肾脏肥大指数显著减小。Que是一种天然的黄酮类化合物，具有抗氧化、抗炎、抗黏附、抗血栓、抗病毒、抗肿瘤、降血糖、降血脂、降低血压以及免疫调节作用［8］。Que可以降低肾组织丙二醛(MDA)含量，提高超氧化物歧化酶(SOD)活力并减少尿素氮(BUN)、肌酐(Scr)、24 h蛋白尿，抑制肾内一氧化氮合酶活性和一氧化氮(NO)水平，抑制糖尿病肾脏早期的高灌注、高滤过［2］。Que作为一种有效的抗氧化和抗炎剂，对DN的发展起到一定的抑制作用，其机制可能是通过改善氧化应激、抑制肾内TLR4的表达，进而切断TLR4介导的多种介导炎症及急性期反应的细胞因子形成，从而减轻肾脏炎症的损害。

肾小管上皮细胞生长异常导致糖尿病早期肾脏增大、肾小管过度重吸收和肾小球高滤过，影响肾脏病变的进程，这与多个分子及信号通路、炎性反应和纤维化密切相关［9］。Na+，K+-ATPase是近端小管上皮细胞管周膜上的重要离子泵，参与多种物质的重吸收。其活性反映了肾小管的功能状态，活性显著升高，与DN的发生发展有显著的相关性［10］。本研究提示，Que抑制肾脏肥大的机制可能与降低血糖、血脂等物质在近端小管上皮细胞的重吸收和转运过程，稳定Na+，K+-ATPase的活性有关，具体的途径有待进一步的深入研究。

［1］ 李列平，李雄，彭自全，等．槲皮素对大鼠慢性肾功能衰竭及促红细胞生成素水平的影响［J］．中国医院药学，2004，24 (7):412-413．

［2］ 王兴红，郑亚萍，魏芳．槲皮素对链脲佐菌素诱导糖尿病大鼠氧自由基和一氧化氮的影响［J］．中国实验方剂学杂志，2013，19(5):244-247．

［3］ 王保伟，李颖，刘晓红，等．高脂饲料喂养时间及链脲佐菌素剂量对实验型2型糖尿病大鼠造模的影响［J］．卫生研究，2011，40(1):99-102．

［4］ 李光伟，潘孝仁，Lillioja，等．检测人群胰岛素敏感性的一项新指数［J］．中华内科杂志，1993，32(10):656．

［5］ 沈东波，高原，杜飞．灯盏花素在大鼠糖尿病早期对近球小管钠钾ATP酶活性的影响［J］．中国药理学通报，2007，23(7): 917-920．

［6］ The role of toll-like receptors in diabetes-induced inflammation: implications for vascular complications［J］．Current diabetes reports，2012，12:172-179．

［7］ 王建平，臧丽，张世静，等．辛伐他汀对糖尿病大鼠肾组织Toll样受体4表达的影响［J］．中华内分泌代谢杂志，2011，27(11):945-946．

［8］ CM Liu，YZ Sun，JM Sun，et al．Protective role of quercetin against lead-induced inflammatory response in rat kidney through the ROS-mediated MAPKs and NF-κB pathway［J］．Biochimica et Biophysica Acta(BBA)-General Subjects，2012，1820(10): 1693-1703．

［9］ Kanwar YS，Sun L，Xie P，et al．A glimpse of various pathogenetic mechanisms of diabetic nephropathy［J］．Annu RevPathol，2011，6:395-423．

［10］ Nakhoul N，Batuman V．Role of Proximal Tubules in the Pathogenesis of Kidney Disease［J］．Contrib Nephrol，2011，169: 37-50．

Influencing Mechanism of Quercetin on Kidney Hypertrophy in Type 2 Diabetic Rats

WANG Xing-hong，CHANG Lu-lin，WANG Gui-ye，LIU Hui-jun
(Luohe Medical College，Luohe，Henan，462000，China)

Objective:To observe the effect of quercetin on diabetic rats’kidney hypertrophy and explore its mechanism．Methods:The model of type 2 diabetic rates was made．The rats were randomly divided into three groups: normal group，diabetic model group，and quercetin group．The blood sugar，blood fat，total cholesterol，serum insulin level，insulin sensitivity index(ISI)，KW/BW，Na+，K+-ATPase activity of PT were measured．The toll-like receptor 4(TLR4) protein expression was measured by immunohistochemical method．Results:Compared with the model group，The blood sugar，blood fat，total cholesterol，serum insulin level，KW/BW，Na+，K+-ATPase activity of PT，TLR4 protein expression were significantly reduced，so the differences were statistically significant．Conclusion:Quercetin can inhibit kidney hypertrophy，it may be caused by the decrease of blood sugar，blood fat，cholesterol，TLR4 protein expression and increase of ISI and stabilization of Na+，K+-ATPase activity of PT in T2DM rats．

Type 2 diabetes mellitus;Quercetin;Kidney hypertrophy;TLR4;Na+，K+-ATPase

R285．5

B

1006-3250(2015)10-1248-03

2015-03-11

河南省教育厅高等学校重点科研项目(15B180011);漯河医学高等专科学校校级自然科学研究资助项目(2013-S-LMC24)

王兴红(1981-)，女，山东临沂人，讲师，医学硕士，从事糖尿病肾病的发病机制与防治研究。