补肾壮骨中药复方对去卵巢骨质疏松症大鼠骨组织Dlx5 mRNA及蛋白表达的影响*

王 剑，郑洪新，张锦萍，刘 研，刘剑辉，宋光熠，刘瑞辉

(1．辽宁医药职业学院，沈阳 110101;2．辽宁省基础医学研究所，沈阳 110101; 3．辽宁中医药大学基础医学院，沈阳 110847)

补肾壮骨中药复方对去卵巢骨质疏松症大鼠骨组织Dlx5 mRNA及蛋白表达的影响*

王 剑1，2，郑洪新3△，张锦萍1，刘 研1，刘剑辉1，宋光熠1，刘瑞辉1

(1．辽宁医药职业学院，沈阳 110101;2．辽宁省基础医学研究所，沈阳 110101; 3．辽宁中医药大学基础医学院，沈阳 110847)

目的:通过骨组织Dlx5 mRNA及蛋白表达，探讨绝经后骨质疏松症(PMOP)的发病机制以及补肾壮骨中药复方的疗效机理。方法:去卵巢复制骨质疏松症大鼠模型按随机数字表法分为正常组、模型组、假手术组、补肾组、钙尔奇D组、骨疏康组，灌胃12周检测骨密度、Dlx5 mRNA及蛋白表达。结果:与正常组比较，模型组股骨骨密度明显降低，骨组织Dlx5 mRNA及蛋白表达明显降低;与模型组比较，补肾组、骨疏康组股骨骨密度明显升高，补肾组、骨疏康组骨组织Dlx5 mRNA及蛋白表达明显上调。结论:PMOP的发病机制之一可能是骨组织Dlx5 mRNA及蛋白表达降低，补肾壮骨中药复方可能通过上调骨组织Dlx5 mRNA及蛋白表达，有效防治绝经后骨质疏松症。

绝经后骨质疏松症;补肾壮骨中药复方;Dlx5

绝经后骨质疏松症(postmenopausal osteoporosis，PMOP)是临床常见的慢性进行性疾病，主要表现为长期骨吸收超过骨形成，骨量逐渐减少，骨强度降低，骨结构破坏［1］，其确切发病机制尚不完全清楚，亦无特效防治方法。目前防治主要应用维生素D和钙剂，但PMOP多因钙沉积和流失所致，故单纯补钙未能产生良好的疗效［2］。远端缺失同源盒5 (distal-less homeobox 5，Dlx5)在调节哺乳动物成骨细胞分化中起关键作用［3］。本研究以骨组织Dlx5 mRNA及蛋白表达为效应指标，探讨以中医“肾主骨”理论为指导研制的补肾壮骨中药复方的疗效机理，为中医药防治PMOP提供实验依据。

1 材料

1.1 动物

4～5月龄SPF级Wistar雌性大鼠100只(辽宁长生生物技术有限公司，合格证号0004179)，体质量(275±25)g。

1.2 药品

补肾壮骨中药复方(鹿茸、淫羊藿、牡蛎)、钙尔奇D(Wyeth)、骨疏康颗粒(辽宁康辰药业有限公司)。

1.3 主要仪器

XR-36型双能X线骨密度仪(NORLAND)、ABI 7500型定量PCR仪、电泳仪(BIO-RAD，PowerPac200)等。

1.4 主要试剂

TRIZOL(康为世纪)、实时定量RT-PCR试剂盒(TaKaRa)、羊抗Dlx5多克隆抗体(santa cruz)、碱性磷酸酶标记的兔抗羊IgG(北京中山生物公司)等。

2 方法

2.1 分组

预实验7只，余者按随机数字表法分为正常组(A)12只，模型组(B)12只，假手术组(C)12只，补肾组(D)20只，钙尔奇D组(E)18只，骨疏康组(F)19只。

2.2 造模

正常组除外，余者2%戊巴比妥钠腹腔注射(35 mg/kg)麻醉，手术从腹部切除双侧卵巢，假手术组只切开切口而不切除卵巢。

2.3 给药

大鼠等效剂量按成人6.3倍计算，给药容积0.5 ml/100 g。A、B、C 3组给予生理盐水，D组给予补肾壮骨中药复方(1.139 g·kg－1·d－1)，E组给予钙尔奇D(0.126 g钙·kg－1·d－1)，F组给予骨疏康颗粒(2.1 g·kg－1·d－1)。术后7 d开始每日灌胃1次，连续12周。

2.4 指标检测

2.4.1 骨密度(BMD) 取右后肢全股骨剔除筋肉，外包生理盐水润湿的医用纱布、外裹锡纸，－20℃冰箱冻存待测。应用XR-36型双能X线骨密度仪检测大鼠离体股骨骨密度，附带软件进行数据分析。

2.4.2 Dlx5 mRNA表达 取左后肢股骨头剔除筋肉夹碎，取一半放入装有1 ml Trizol的EP管内，－70℃冰箱冻存待测。检测:①抽提总RNA;②测吸光度，OD260/OD280约为2.0，证明为RNA纯品;③反转录，实时定量PCR扩增。北京华大基因公司合成引物。Dlx5上游引物:5'-GCCACCGATTCTG ACTACTA-3'，下游引物:5'-CGTTCACGCTGTG ATACTG-3'，扩增产物长度121 bp。内参GAPDH上游引物:5'-CGT ATC GGA CGC CTG GTT-3'，下游引物:5'-CGT GGG TAG AGT CAT ACT GGA AC-3'，扩增产物长度 124 bp;④计算 Ct值，以 2－△△Ct(Livak)法对Dlx5 mRNA表达相对定量。

2.4.3 Dlx5蛋白表达 取夹碎股骨头的另一半放入空白 EP管内，－70℃冰箱冻存待测。Western Blot步骤:提取总蛋白、蛋白定量、SDSPAGE凝胶电泳、转印、抗体孵育、显色。计算:数码凝胶成像，分析灰度值，以Dlx5条带灰度值/内参GAPDH条带灰度值来表示其相对蛋白表达。

2.5 统计学方法

采用SPSS 18.0统计软件进行统计分析，数据间比较采用单因素方差分析，P＜0.05为差异有统计学意义。

3 结果

灌胃期间大鼠死亡5只，取材共88只。

3.1 股骨骨密度

表1显示，与正常组比较，模型组明显降低(P ＜0.01);与模型组比较，补肾组、骨疏康组明显升高(P＜0.05)，钙尔奇D组虽有升高趋势，但差异无统计学意义(P＞0.05)。

表1 各组大鼠离体股骨骨密度(±s)

表1 各组大鼠离体股骨骨密度(±s)

注:与正常组比较:＊＊P＜0.01;与模型组比较:△P＜0.05

组别 鼠数 股骨骨密度(g/cm2)正 常 组12 0.1375±0.0063 模 型 组 12 0.1259±0.0060＊＊假 手 术 组 11 0.1331±0.0109△补 肾 组 19 0.1327±0.0095△钙 尔 奇 D 组 17 0.1286±0.0058 骨 疏 康 组 17 0.1321±0.0057△

3.2 骨组织Dlx5 mRNA表达

表2显示，与正常组比较，模型组明显降低(P ＜0.01);与模型组比较，补肾组(P＜0.01)、骨疏康组(P＜0.05)明显上调，钙尔奇D组虽有升高趋势，但差异无统计学意义(P＞0.05);与钙尔奇D组比较，补肾组明显升高(P＜0.05)。

表2 各组大鼠骨组织Dlx5 mRNA表达(±s)

表2 各组大鼠骨组织Dlx5 mRNA表达(±s)

注:与正常组比较:＊＊P＜0.01;与模型组比较:△P＜0.05，△△P ＜0.01;与钙尔奇D组比较:★P＜0.05

组别 鼠数 Dlx5(mRNA)正 常 组10 1.012±0.184 模 型 组 10 0.255±0.029＊＊假 手 术 组 10 1.027±0.132△△补 肾 组 10 0.605±0.028△△★钙 尔 奇 D组 10 0.422±0.064 骨 疏 康 组 10 0.486±0.038△

3.3 骨组织Dlx5蛋白表达

图1表3显示，与正常组比较，模型组明显降低(P＜0.01);与模型组比较，补肾组(P＜0.01)、骨疏康组(P＜0.05)明显上调，钙尔奇D组虽有升高趋势，但差异无统计学意义(P＞0.05);与钙尔奇D组、骨疏康组比较，补肾组明显升高(P＜0.01)。

图1 骨组织Dlx5、GAPDH蛋白Western Blot条带

表3 各组大鼠骨组织Dlx5蛋白表达(±s)

表3 各组大鼠骨组织Dlx5蛋白表达(±s)

注:与正常组比较:＊＊P＜0.01;与模型组比较:△P＜0.05，△△P ＜0.01;与钙尔奇D组比较:★★P＜0.01;与骨疏康组比较:※※P＜0.01

组别 鼠数 Dlx5(蛋白)正 常 组10 1.082±0.064 模 型 组 10 0.734±0.023＊＊假 手 术 组 10 1.067±0.043△△补 肾 组 10 0.943±0.036△△★★※※钙 尔 奇 D组 10 0.749±0.019 骨 疏 康 组 10 0.803±0.029△

4 讨论

现代医学研究表明，PMOP是一种与衰老有关的常见病，主因之一是雌激素缺乏，雌激素能促进早期成骨细胞分化并抑制破骨细胞活性。妇女绝经后雌激素缺乏，破骨增加、成骨减少，打破了二者之间的平衡，导致骨量减少、微结构破坏、强度减低、脆性增加且易于骨折，从而引起骨痛、骨骼变形等，最终导致PMOP［4-5］。西药治疗有雌激素、氟化物、钙剂等，主要功效是抑制破骨、促进成骨，但这些药物毒性及不良反应普遍存在［5-6］，为此我们更希望选择一种安全、有效的药物来改善病情，所以有着确切疗效的中药制剂日益受到研究者的青睐［7］。

中医古籍中虽未记载“骨质疏松症”，但颇多论述骨病的文献。如《素问·长刺节论》:“病在骨，骨重不可举，骨髓酸痛，寒气至，名曰骨痹。”《中藏经·论骨痹第三十八》:“骨痹者，乃嗜欲不节，伤于肾也。”《千金要方·骨极》:“骨极者，主肾也，肾应骨，骨与肾合……若肾病则骨极，牙齿苦痛，手足疼，不能久立，屈伸不利，身痹脑髓酸。”《扁鹊心书·骨缩》:“此由肾气虚惫，肾主骨，肾水既涸，则诸骨皆枯，渐至短缩。”从上述论述可以看出，“骨痹”、“骨极”、“骨缩病”均与骨质疏松症的表现类似，病机均责之于肾。肾主藏精，精生髓，髓居骨中充养之，若肾虚精亏无以生髓养骨则发骨质疏松。《素问·上古天真论》:“女子七岁，肾气盛，齿更发长;二七而天癸至……月事以时下……三七肾气平均，故真牙生而长极;四七筋骨坚……七七……天癸竭，地道不通。”亦说明肾精盛衰关系到骨的强劲脆弱、肾精充盛、髓足骨强;女子七七天癸竭，肾虚精亏，髓减骨枯，即发绝经后骨质疏松症。因此，肾虚精亏、髓减骨枯是PMOP的根本病机，补肾填精、益髓壮骨法是防治该病的根本大法。

Dlx5属于同源异型盒(homeobox，Hox)基因家族，含3个外显子和2个内含子［8］。Simeone等在鼠骨中发现，Dlx5是一种在调节哺乳动物成骨细胞分化中起关键作用的转录因子［3，9］。人的 Dlx5定位于染色体7q22位点，接近Hoxa簇，且人与鼠Dlx有高度同源性［8］。在骨钙素、骨涎蛋白和I型胶原的调控序列上均存在Dlx5的结合位点［8-10］。Dlx5与之结合，促进其基因转录，从而促进骨基质的矿化［3］。Dlx5亦可增强Runx2基因P1启动子的活性，从而促进成骨细胞的分化［11］。新近发现，Dlx5介导BMP2诱导的 Runx2表达、介导BMP2调控Osterix的功能，从而促进成骨细胞分化和成熟［8，12］。综上所述，Dlx5作为成骨分化的关键转录因子能够调控成骨细胞分化及成骨特异基因表达，在骨质疏松症的防治中具有重大意义。

笔者前期实验研究表明［13］，糖皮质激素性骨质疏松症的发病机制可能与骨组织Dlx5 mRNA及蛋白表达降低有关;补肾中药复方可上调其表达，有效防治该病。但笔者尚未查阅到Dlx5在绝经后骨质疏松症的发病机制以及中医药防治该病方面的相关文献报道。本研究在中医“肾藏精生髓主骨”理论的指导下，依据PMOP肾虚精亏、髓减骨枯的根本病机，建立补肾填精、益髓壮骨法，研制补肾壮骨中药复方，以骨组织Dlx5 mRNA及蛋白表达为效应指标，探讨PMOP的发病机制以及补肾壮骨中药复方的疗效机理。方中以鹿茸(辽宁清原鹿场密生茸毛未骨化的雄马鹿幼角，应用冻干技术制备鹿茸冻干粉，其所含的多种生长因子均可保持良好活性)为君药，生精补髓、养血益阳、强筋健骨(《本草纲目》);以淫羊藿(水提法制备淫羊藿提取物微粉)为臣药，补肾虚(《医学入门》)、益精气(《本草纲目》)、坚筋骨(《别录》);佐以牡蛎(长山岛大连湾牡蛎贝壳，应用纳米技术制备纳米钙微粒，更有利于其所含钙的吸收)补肾(《海药本草》)、强骨节(《神农本草经》)、滋阴潜阳，三者混合制成补肾壮骨中药复方，全方共奏补肾填精、益髓壮骨之功。本实验选用骨质疏松症临床治疗常用西药钙尔奇D(主要功效是促进肠道对钙、磷的吸收和骨正常钙化)和首个中药复方骨疏康颗粒(功能补肾益气、活血壮骨)作为对照药，与本研究补肾壮骨中药复方的疗效相比较。本实验采用切除雌性大鼠双侧卵巢的经典方法复制PMOP动物模型［14］，结果显示模型组骨密度比正常组显著降低，说明本实验PMOP动物模型复制成功。模型组骨组织Dlx5 mRNA及蛋白表达比正常组显著降低，可能通过影响骨钙素、骨涎蛋白、I型胶原、Runx2基因的表达和Osterix的功能抑制成骨细胞分化、成熟和骨形成，导致骨质疏松。与模型组比较，补肾壮骨中药复方明显上调骨组织Dlx5 mRNA及蛋白表达，可能通过促进骨钙素、骨涎蛋白、I型胶原、Runx2基因的表达和调控Osterix的功能而促进成骨细胞分化、成熟和骨形成，从而使骨密度显著升高，较之骨疏康颗粒疗效更优;钙尔奇D虽然也使骨组织Dlx5 mRNA及蛋白表达和骨密度有所升高，但均无统计学意义。因此，绝经后骨质疏松症的发病机制之一可能是骨组织Dlx5 mRNA及蛋白表达降低;补肾壮骨中药复方可显著上调骨组织Dlx5 mRNA及蛋白表达，有效防治该病，疗效较之骨疏康颗粒及钙尔奇D更优。故临床防治绝经后骨质疏松症可选用补肾填精、益髓壮骨法。

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Effect of Reinforcing Kidney to Strengthen Bone Traditional Chinese Medicine Compound on mRNA and Protein Expression of Dlx5 in Bone Tissues of Ovariectomized Osteoporosis Rats

WANG Jian1，2，ZHENG Hong-xin3△，ZHANG Jin-ping1，LIU Yan1，LIU Jian-hui1，SONG Guang-yi1，LIU Rui-hui1
(1．Liaoning Vocational College of Medicine，Shenyang 110101，China;2．Liaoning Institute of Basic Medicine，Shenyang 110101，China;3．Basic Medical College，Liaoning University of TCM，Shenyang 110847，China)

Objective:To discuss the pathogenesis of Postmenopausal Osteoporosis(PMOP)and the therapeutic effect and mechanism of reinforcing kidney to strengthen bone traditional Chinese medicine compound by mRNA and protein expression of Dlx5 in bone tissues．Methods:We established the osteoporosis rat models by ovariotomy．We divided all the rats into normal group，model group，sham-operated group，reinforcing kidney group，GAIERQI D group and GUSHUKANG group．After 12 weeks of gavage，we detected bone mineral density，mRNA and protein expression of Dlx5．Results:①Compared with normal group，femur bone mineral density of model group decreased significantly，mRNA and protein expression of Dlx5 decreased significantly in bone tissues．②Compared with model group，femur bone mineral density of reinforcing kidney group and GUSHUKANG group increased significantly;mRNA and protein expression of Dlx5 of reinforcing kidney group and GUSHUKANG group up-regulated significantly in bone tissues．Conclusions:Maybe it is one aspect of the pathogenesis of PMOP that mRNA and protein expression of Dlx5 decreases in bone tissues;Reinforcing kidney to strengthen bone traditional Chinese medicine compound can prevent and treat PMOP by up-regulating mRNA and protein expression of Dlx5 in bone tissues．

Postmenopausal Osteoporosis(PMOP);Reinforcing kidney to strengthen bone traditional Chinese medicine compound;Distal-less homeobox 5(Dlx5)

R285．5

B

1006-3250(2015)10-1238-03

2015-02-23

辽宁省教育厅科学研究一般项目(L2011247)-补肾益髓法对绝经后骨质疏松症Runx2相关基因表达的级联调控作用

王 剑(1978-)，女，辽宁沈阳人，副教授，医学博士，从事中医药与分子生物学相关研究。

郑洪新，教授，博士研究生导师，从事中医病因病机理论研究，Tel:13604076118，E-mail:zhenghx2002@126．com。