正交设计法筛选“肠病方”最佳刺激参数组合的研究*

闫丽萍， 冀来喜，祁 超，双 源，燕 平

(山西中医学院，太原 030024)

正交设计法筛选“肠病方”最佳刺激参数组合的研究*

闫丽萍， 冀来喜△，祁 超，双 源，燕 平

(山西中医学院，太原 030024)

目的:采用正交设计方法筛选电针治疗肠黏膜损伤的最佳刺激参数组合。方法:制备大鼠肠黏膜损伤模型，以三因素三水平组合电针腧穴“肠病方”，观察肠黏膜损伤指数及组织学变化。结果:各刺激参数治疗作用的显著性排列为电针频率＞留针时间＞治疗频次，治疗频次影响不显著。各因素中不同水平影响排序为:100 Hz＞30 Hz＞2 Hz;30 min＞20 min=10 min;每日2次、2 d 1次、每日1次均可。结论:电针腧穴“肠病方”治疗肠黏膜损伤的最佳刺激参数组合为:100 Hz，30 min，每日2次。

“肠病方”;电针;正交设计;肠黏膜损伤

临床研究表明，针灸对肠系疾病有较好的治疗作用［1-2］。2009年在国家自然科学基金的资助下，冀来喜教授［3］等筛选出治疗结肠黏膜损伤的最佳组方，即天枢、中脘、上巨虚三穴，并将其冠名为“肠病方”。然而针刺疗效的影响因素除了不同的腧穴组方外，刺激量及时间等因素也非常重要。因此，在腧穴“肠病方”的基础上，以正交设计方法进一步研究逆转结肠黏膜损伤的电针频率(2 Hz、30 Hz、100 Hz)、留针时间(10 min、20 min、30 min)、针刺间隔时间(每日1次、每日2次、2 d 1次)的最佳电针刺激参数组合，为临床制定科学完善的针刺治疗方案提供实验室参考依据。

1 材料

1.1 动物

清洁级SD大鼠110只，体质量(180±20)g，雌雄各半，标准饲料喂养，动物及饲料均由北京维通利华实验动物技术有限公司提供(合格证编号SCXK (京)2012-0001)。

1.2 主要仪器

华佗牌SDZ-Ⅱ型电子针疗仪(苏州医疗用品厂有限公司);BM-VⅡ生物组织包埋机(孝感市宏业医用仪器有限公司);BM-VⅡ冷冻台(孝感市宏业医用仪器有限公司);CS-VⅠ摊片烤片机(孝感市宏业医用仪器有限公司);QP-V生物组织切片机(孝感市宏业医用仪器有限公司);OLYMPUS-BX53正置荧光显微镜(日本奥林巴斯)。

1.3 主要试剂

冰乙酸(天津市北辰方正试剂厂);甲醛(天津市第三化学试剂厂);二甲苯(天津市第三化学试剂厂)。

2 方法

2.1 动物分组与造模

110只大鼠按随机数字表法分为空白组(n= 10)、模型组(n=10)、针刺干预Ⅰ～Ⅸ组(均n= 10)。以上各组动物实验前24 h禁食不禁水。造模时，将直径为2 mm的聚氯乙烯管插入大鼠肛门内8 cm。模型组、针刺干预组取6%的冰醋酸1 ml灌肠，15 s后再灌入生理盐水5 ml，建立急性结肠黏膜损伤大鼠模型［4］。空白组取生理盐水1 ml灌肠，15 s后灌入生理盐水5 ml。

2.2 处理方法

表1显示，采用正交实验设计方法［5］，针刺三因素三水平。表2显示，按L9(34)正交表设计安排实验。造模后即刻按表2的实验安排对每组大鼠施以相应组合的针刺治疗，正常组和模型组大鼠除与针刺干预组做同样的抓取固定外，不做任何处理。针刺治疗组每组针刺治疗3次，末次治疗24 h后麻醉取材。

表1 电针刺激参数

表2 针刺干预组9个亚组实验安排表

取穴参照《实验针灸学》［6］穴位标准定位。中脘:脐上20 mm;天枢(双侧):脐中［7］旁开5 mm;上巨虚(双侧):大鼠后肢足三里向下约5 mm。

2.3 观察指标

2.3.1 结肠黏膜损伤指数 各组大鼠以20%乌拉坦(0.6 ml/100 g)腹腔注射麻醉固定，沿腹白线剪开大鼠腹腔，剪下距肛门12cm结肠，生理盐水冲洗，观察结肠黏膜损伤情况，计算结肠黏膜损伤指数［8］。

2.3.2 组织学观察 将大鼠距肛门8 cm处表面积约1 cm×1 cm左右的结肠(肠壁全层)剪下，置于10%的甲醛溶液中固定，HE染色，普通光镜下观察肠黏膜的损伤程度。

2.4 统计学方法

应用SPSS 17.0统计软件进行统计分析，组间比较采用秩和检验(M±QR)，正交分析采用方差分析，P＜0.05为差异有统计学意义。

3 结果

3.1 各组大鼠结肠黏膜损伤指数、组织学评分结果

各组大鼠 2项评分经正态性检验，均 P＜0.001，表明数据均不满足正态性，故采用秩和检验。经两两秩和检验比较均P＜0.05，说明针刺干预组和空白组、模型组比较差异有统计学意义，具有可比性。

表3 各组结肠黏膜损伤指数、组织学评分秩和检验

3.2 正交试验结果

表4～6显示，因素 A、B影响显著(均 P＜0.05)，因素C影响不显著(P＞0.05)。由F值可得出三因素影响的主次顺序为A＞B＞C(电针频率＞留针时间＞治疗频次)，因素A和B对本项指标结果有显著性影响(均P＜0.05)，其中A3、B3最为适合;因素C对结肠黏膜损伤指数的影响不显著(P＞0.05)，3个水平均可。但本模型是急性损伤，结合针灸临床经验以及急性病症治疗效果考虑每日2次为宜，故电针“肠病方”逆转大鼠急性结肠黏膜损伤的最佳刺激参数组合为A3B3C2，即100 Hz、30 min、每日2次。

表4 不同针刺干预方法对大鼠结肠黏膜损伤指数及组织学评分的影响

4 讨论

电针治疗疾病的疗效，与腧穴配伍、电针频率、留针时间、治疗频次等因素密切相关。

频率是电针刺激的重要参数之一，不同频率电针可通过不同的神经化学机制，由不同的中枢通路整合而产生的效应不同［9-10］。本实验结果表明，电针频率对改善大鼠结肠黏膜损伤具有显著影响，100 Hz电针频率疗效优于2 Hz、30 Hz，即100 Hz电针频率可以较好地改善肠黏膜的损伤。

在刺激强度相同情况下，刺激时间在一定范围内与有效刺激量正相关［11］。虽然目前关于留针时间与电针治疗肠病疗效方面的文献较少，但留针时间与电针的疗效有密切联系［12］。本实验结果表明，留针时间对结肠黏膜损伤的影响显著。在本实验的3个水平中，留针时间越长，受损的结肠黏膜恢复情况越好，30 min的留针时间明显优于10 min、20 min。这可以说明，电针留针时间偏短则治疗结肠黏膜损伤效果不佳，只有达到一定的留针时间才会产生明显疗效。

表5 不同针刺干预方法对2项评分指标影响的正交试验直观分析

表6 不同因素对2项指标影响的方差分析

不同的针灸治疗频次可以反映针灸刺激量的积累。一般来说，急性病症来势急骤且凶猛，病情严重，机体受到损伤严重，这就需要相对应较高频次的针灸治疗。慢性病变机体受致病因素的作用时间长，这就需要较长的治疗过程来积累针灸治疗的效果，逐步消除损害。但并非所有疾病都能这样一概而论，这就需要我们具体到某种疾病详细研究对其的针灸治疗频次。本实验结果表明，治疗频次在改善2项指标方面均无显著影响。古代针灸医籍中有“气至而有效”、“气速至而速效”的说法，对于发病急、病情重的疾病，需要在短时间内累积足够的针灸效应。因此，基于本研究模型为急性损伤造成，结合针灸临床经验以及急性病症治疗效果考虑，认为在改善结肠黏膜损伤方面，治疗频次选择每日2次比较符合需要。

在本实验中，电针频率与留针时间是影响“肠病方”治疗急性肠黏膜损伤疗效的显著因素，治疗频次是不显著因素。电针“肠病方”的最佳刺激参数组合为，电针频率100 Hz，留针时间30 min，治疗频次每日2次，而其作用机制则有待进一步深入研究。

［1］魏超博.温针灸治疗溃疡性结肠炎59例［J］.光明中医，2011，26(11):2272-2273.

［2］王宝琛，高忠波，王善旭.温针灸治疗溃疡性结肠炎52例［J］.河南中医，2011，30(10):1105.

［3］闫丽萍，冀来喜，王海军，等.电针治疗肠黏膜损伤大鼠基本腧穴配伍“肠病方”的筛选［J］.针刺研究，2012，37(6):458-463.

［4］马贵同，詹剑烈.中医中药治疗溃疡性结肠炎临床及实验研究［J］.中医杂志，1985，26(7):33.

［5］赵天平，口锁堂，马晓芃，等.正交设计研究艾灸对溃疡性结肠炎大鼠穴区温度和Cx43表达的作用［J］.上海针灸杂志，2010，29(6):335-338.

［6］李忠仁.实验针灸学［M］.北京:中国中医药出版社，2003: 414-417.

［7］王海军，冀来喜.关于大鼠神阙穴的定位［J］.针刺研究，2007，32(5):312.

［8］郑礼，高振强，王淑仙.大鼠溃疡性结肠炎模型的实验研究［J］.中国药理学通报，1998，14(4):370-372.

［9］卢峻，时宇静，金智秀，等.不同频率电针对模型大鼠抗抑郁效应的比较研究［J］.北京中医药大学学报，2003，26(6):83.

［10］林亚平，彭艳，易受乡，等.不同电针频率刺激对胃扩张疼痛大鼠下丘脑内P物质、β-内啡肽表达的影响［J］.针刺研究，2009，31(4):252-256.

［11］马良宵，朱江.留针时间及下针顺序与疗效相关性的研究概述［J］.中国针灸，2005，25(9):667-669.

［12］林树芬，马培峰，万红晨，等.强刺激速刺疗法治疗腓肠肌痉挛38例［J］.中国针灸，2008，28(3):176.

Study on Optimum Acupuncture Parameter for“Changbingfang”by Orthogonal Design

YAN Li-ping，JI Lai-xi△，QI Chao，SHUANG Yuan，YAN Ping
(Shanxi University of Traditional Chinese Mendine，Taiyuan 030024，China)

Objective:Combination of parameters of the using the orthogonal design method to screening the best stimulus electro-acupuncture treatment of intestinal mucosa injury.Methods:Rat intestinal mucosal injury model，Index of intestinal mucosal injury and ordinary optical microscope observation from the cellular level damage to the intestinal mucosa，as observed indicators，factors and three levels orthogonal design method electro-acupuncture acupoints best to enteropathy side screened electrical stimulation parameters.Results:The importance of the stimulation parameters in descending arranged of“Changbingfang”is frequency of electric acupuncture＞retaining time of acupuncture needles＞interval of acupuncture，but the treatment frequency effect was not significant.The sequence of each level in 3 element is: 100 Hz＞30 Hz＞2 Hz;30 min＞20min=10 min;1 time/d，2 times/d and 1 time/2 d have the same effects.Conclusion: The best combination of stimulation parameters for treat bowel disease about acupoints“Changbingfang”is:100 Hz，30 min，2 times/d.

“Changbingfang”;Electro-acupuncture;Orthogonal experimental design;Intestinal mucosa injury

R245.9+7

B

1006-3250(2015)01-0080-03

2014-09-24

国家自然科学基金资助项目-基于针刺信号传导途径与整合机制的腧穴“肠病方”配伍研究(30973799)

闫丽萍(1967-)，女，山西左云人，副教授，医学硕士，从事腧穴组方的研究。

△通讯作者:冀来喜(1964-)，男，山西保德人，教授，主任医师，医学博士，从事腧穴组方的研究，E-mail:Tyjilaixi@126.com。