植物逆境胁迫相关miRNA研究进展

王维 张玉娟 陈洁 刘聚波 夏民旋 沈法富

（山东农业大学农学院 作物生物学国家重点实验室，泰安 271018）

植物逆境胁迫相关miRNA研究进展

王维 张玉娟 陈洁 刘聚波 夏民旋 沈法富

（山东农业大学农学院 作物生物学国家重点实验室，泰安 271018）

MicroRNAs（miRNAs）是一类内源性小分子的非编码RNA，它通过对其靶基因mRNA的降解或抑制翻译来调控基因表达，进而参与调控植物相关生理活动。在逆境胁迫下，植物中的一些miRNA通过迅速表达并作用于某些与逆境相关的基因，以启动植物的某些抗逆信号系统，进而提高植物对不良环境的适应能力。就miRNA的产生、作用方式、研究方法及其在植物在逆境胁迫中的抗逆作用机制研究进行了综述，并对植物miRNA的研究发展趋势进行了展望。

MicroRNA；胁迫；生物信息学；靶基因；基因调控

DIO： 10.13560/j.cnki.biotech.bull.1985.2015.01.001

逆境胁迫是限制作物生长、影响产量和品质的重要因素之一。逆境胁迫分为生物逆境和非生物逆境，生物逆境主要包括病害和虫害；非生物逆境包括养分胁迫、干旱胁迫、水分胁迫、高温胁迫和低温胁迫等［1］。MicroRNA（简称miRNAs）是长度为20-25 nt的内源RNA，最早由Lee等在线虫（Caenorhabditis elegans L.）中发现［2-4］，后来利用直接克隆测序和生物信息学等方法在许多高等植物中发现了大量的miRNA，如拟南芥（Arabidopsis thaliana L.）［5］、苔藓（Moss L.）［6］、水稻（Oryza sativa L.）［7］、玉米（Zea mays L.）［8］、小麦（Triticum aestivum L.）［9］等。近年来，随着对模式植物miRNA的深入研究发现，miRNA在植物生长发育、维持基因组完整、抗逆境胁迫等生理过程中发挥重要作用［10］。在多种逆境胁迫下，对植物miRNA进行研究发现，植物通过引起某些物质的积累和改变代谢途径，从而对逆境胁迫出适应性调整，同时miRNA存在差异表达［5，11，12］。从miRNA的角度深入研究植物在胁迫条件下的表现，有利于阐明植物耐胁迫机理和提高植物耐胁迫能力，对创新作物种质资源和培育抗胁迫新品种奠定坚实的理论基础。

1 植物miRNA的产生及作用方式

1.1 miRNA的产生

MicroRNAs（简称miRNAs）普遍存在于生物体内，是由内源基因编码的长度为20-25 nt左右的单链非编码小分子RNA［13］。植物miRNA经过转录、加工成熟和功能复合体装配3个主要步骤完成生物合成。

1.1.1 转录 大部分植物miRNA由非编码的核基因转录而来，通过II型RNA聚合酶转录形成初级转录本，称为primary miRNAs（Pri-miRNAs）［14，15］。植物的pri-miRNA通常由腺苷酸开头，具有5'帽子和3'-polyA尾，位于一个保守的TATA-box序列的下游40 nt处［16］。植物miRNA基因通常以单拷贝形式大多数存在于基因之间的间隔区（Intergenicregion，IGR），少数位于已知基因的内含子区域［17］。

1.1.2 加工成熟 植物miRNA的加工成熟过程是由存在细胞核内的Dicer酶类似物（Dicer-like1，DCL1），在Hyponastic leaves1（HYL1）蛋白的协助下，以一种ATP依赖的方式，通过两次剪切步骤生成［18］。首先，pri-miRNA在细胞核内加工成具有发卡环结构的前体（pre-miRNAs）［19］，长度约60-200 nt，每个片段的3'端都有2个碱基突出［18，20］。随后，植物体内的Exportin-5的同源蛋白（HASTY，HST）识别前体3'端的碱基突出信号，将前体转运到细胞质中［14，16］，在两个蛋白酶HYL1和SERRATE（SE）的协助下［21，22］，剪切成约21-24 nt长的miRNA∶miRNA*双链复合体［18］。植物miRNA在Dicer加工之后，由HEN1作为转甲基酶完成甲基化［23］。

1.1.3 功能复合体装配 解旋酶（Helicase）将甲基化后的miRNA/miRNA*二聚体解旋，miRNA单链与AGO等蛋白形成RNA诱导沉默复合体（RNA-induced silencing complex，RISC），而星号链则被降解掉［24］。星号链被降解的原因是miRNA∶miRNA*的两条链不完全配对，miRNA链上靠近5'端有一个不与星号链相应位置配对的小突起，明显减弱了miRNA链5'端的稳定性［25］，而成熟miRNA的产生总是趋向于选择5'端更不稳定的链。

1.2 miRNA的作用方式

植物miRNA与其靶mRNA的序列互补的程度决定了其调控机制是对靶mRNA的剪切，或是对靶mRNA翻译的阻遏［26］。当miRNA与靶mRNA完全互补或接近完全互补时，则会切割mRNA；当植物miRNA与靶mRNA不完全互补时，则抑制其翻译［27］。与哺乳动物miRNA作用方式相比，植物miRNA对靶mRNA的主要作用方式是剪切［16］。近年来研究发现，miRNA也可以通过目标染色体位点的甲基化，或通过调控靶mRNA的定位或稳定性在转录水平上发挥作用［28］。

2 植物miRNA的研究方法

2.1 发现miRNA的方法

在miRNA的研究初期，人们通过正向遗传学方法发现新的miRNA［29］。目前，植物中只有拟南芥miR164是通过这种方法被发现，该方法获得miRNA的效率很低［30］。近年来，随着生物信息学、分子生物学及其相关技术的迅速发展，目前人们主要利用直接克隆测序技术和计算机预测来发现miRNA。

2.1.1 直接克隆测序技术 直接克隆测序技术的基本流程，首先构建cDNA文库，再将这些cDNA进行克隆、测序［31］。然后利用NCBI中的BlastN软件，将克隆得到的序列在该物种基因组数据库中进行同源性搜索，用Mfold等程序对具有同源性的基因组序列进行二级结构预测分析［32］，最后将具有发夹结构的小分子RNA进行Northern杂交，将符合miRNA标准的小分子RNA鉴定为新的miRNA［33］。利用直接克隆测序技术，从拟南芥中分别克隆得到了16、125和11个miRNAs［34-36］。之后又采用这种方法分别从拟南芥［37］、水稻［38］、小麦［9］、玉米［8］等植物中得到了大量miRNA。直接克隆测序方法，操作流程多且繁琐，难以鉴定丰度低的或碱基构成特殊、存在转录后修饰的miRNA，具有局限性［39］。近年来，随着高通量测序（Deep parallel squencing）技术的发展，弥补了直接克隆测序技术难以鉴定低丰度表达miRNA的缺点。结合高通量测序使用直接克隆测序技术，已经绘制了拟南芥小分子RNA的基因组分布图谱［40］。这对包括miRNA在内的各种内源小分子RNA的深入研究有着重要意义。

2.1.2 计算机预测法 计算机预测法是利用前体miRNA基因具有较稳定发夹结构的二级结构搜寻miRNA，常用的程序有findMiRNA［41］、Mirfold［42］等。利用这些程序对拟南芥和水稻基因组中的miRNA基因进行分析，筛选出了5个新家族中23个候选植物miRNA，随后用实验进行了验证，证实了预测的真实性［41］。利用这种方法在20多种植物及病毒中预测得到了数百条miRNA序列［43］。随着人们对miRNA研究的深入发现，利用计算机方法预测得到的miRNA存在一定的假阳性，因为并不是所有miRNA在进化过程中具有保守性，也不是所有能形成发卡环结构的都是miRNA，如在tRNAs和rRNAs中也可形成发卡环结构，其真实性需经过生物学实验进一步验证［44］。但是，计算机方法有其他方法无可比拟的优点，简单有效、时间短、花费少，以及可获得一些表达水平低、组织特异性表达以及特定环境诱导表达的miRNA［45］。

2.2 miRNA靶基因的预测与验证

目前对miRNA靶基因进行功能注释，主要利用生物信息学预测其靶基因和生物学实验方法验证结合的方式。其中生物信息学方法预测miRNA靶基因常用的软件有：miRanda、TargetScan、RNAhybrid、DIANA-microT、PicTar及FindTar等［46］。

预测得到的靶基因一般都要通过生物学实验验证其真实性，但是目前对miRNA靶基因进行实验验证还没有一个快速、简便、高通量的鉴定方法。剪切产物5'-RACE是植物中最常用的验证miRNA靶基因的方法［47］。许多研究利用该方法验证了miRNA靶基因，并且发现，这种剪切作用通常精确发生在miRNA第10或11位碱基处［48］。另一种验证靶基因的有效途径是，在miRNA过量表达后，使用mRNA表达芯片分析。当某些miRNA只行使翻译抑制功能，表达芯片则无法检测靶基因。确定miRNA与靶基因的对应关系还可以利用荧光定量PCR及Western blot方法，分别检测转染或敲除miRNA后细胞中mRNA水平及蛋白水平的变化［49］。该方法虽然能够直接准确地鉴定出miRNA的靶基因，但是不能鉴定miRNA的靶位点。近几年涌现出一些不依赖预测和过表达的研究方法，直接检测被剪切的miRNA靶基因，“降解组测序法”（Degradome sequencing）就是其中之一［50］。

3 植物逆境胁迫相关的miRNA

植物逆境胁迫（干旱、水分、温度、养分及病菌侵染等）可以在转录水平、转录后水平和翻译水平上调控植物相关基因的表达［51］。而转录后水平的调控，特别是转录因子直接与保守顺式作用启动子元件结合来调控靶基因的调控方式，在逆境胁迫下基因表达调控中较为普遍［52］。已有的研究表明，miRNA在植物逆境胁迫下的调控机制可能属于转录后水平的调控，目前尚不明确其调控机制［12］。阐明这种由miRNA介导下的调控网络有助于进一步明确植物耐胁迫机理，进而通过基因工程手段和分子生物学方法提高作物的耐胁迫能力，改良植物种质资源［53］。

3.1 植物生物胁迫相关miRNA

植物病虫害是一个广泛影响植物生长发育的生物因素。每年因植物病毒感染而导致大多数农作物和果树减产30%左右［54］。在长期的进化过程中，植物已经形成了一些抵制病毒感染的机制，其中一种机制就是病毒介导的转录后基因沉默。已有越来越多的证据表明miRNA与病毒介导的疾病以及病毒诱导的基因沉默有关［55］。植物在miRNA的指导下，通过类似于RNA干涉的形式，切割病毒RNA和病毒通过miRNA作用指导切割多种调控性靶mRNA的方式来干扰宿主细胞的基因表达［56］。

2009年，Feng等［57］率先检测了与病毒相关的番茄miRNA，其后研究表明miRNA在黄瓜花叶病毒（Cucumer mosaic virus，CMV）、番茄不孕病毒（Tomato aspermy virus，TAV）、番茄卷叶新德里病毒（Tomato leaf curl new delhi virus，ToLCNDV）、番茄灰霉病等病害的防御和发生中均发挥重要的调控作用。非洲木薯花叶病毒（Africancassava mosaic virus）编码的AC4蛋白，能与拟南芥miR159结合，阻止其对正常目标mRNA的调控，从而干扰了转录后基因沉默共抑制过程［58］。孙广鑫等［59］通过构建Cytoscape网络图，筛选出番茄中与致病密切相关的miRNA，并对选出的miR169、miR482、miR5300、miR6024、miR6026和miR6027进行靶基因功能分析和启动子分析后发现，这6个miRNA的靶基因和启动子基本都与抗病性相关，表明它们极可能参与了番茄对生物胁迫响应的调控过程。2011年，Zhang等［60］对未处理、致病性和非致病性Pst处理6 h和14 h后的拟南芥建立了13个小RNA库，测序后发现分别有15个、17个和20个miRNA家族出现显著的表达差异。其中包括保守性较高的miR156a/b/c/e/f、miR159b/c和miR166等，以及保守性较低的miR852、miR825和miR843等。Yin等［61］通过在接种黄萎病棉花根中调查miRNA和非编码小RNA的转录，构建了4个小RNA文库，在两个抗感棉花品系中共鉴定了215个miRNA家族，其中14个是新的miRNA，并且发现在文库中有多于65个miRNA家族出现表达差异，在接种黄萎病后，它们的表达量也出现差异。棉花miR862和miR1536在经过黄萎病处理后表达量显著下降，意味着其靶基因TCH4表达量上调，从而在抵御黄萎病菌侵染过程中发挥重要作用。姜兆远等［63］运用Affymetrix基因表达谱芯片和miRNA芯片对接种稻瘟病的水稻进行关联性分析发现，osamiR399i_st在抗病初期上调，其靶基因RGA1抗病蛋白在抗病初期下调表达，表明osa-miR399i_st在转录后调控靶基因RGA1过程中起关键作用；由于斑点叶基因突变可提高水稻对白叶枯病的抗性［62］，该研究发现控制病原菌在寄主叶片上症状的斑点叶基因，在抗病初期下调表达并受osa-miR812c_st的调控，从而说明osa-miR812c_st可能对抗稻瘟病也有一定的作用。罗茂等［64］利用生物信息学筛选到出23条新的玉米miRNA，预测到89个靶基因，以对纹枯病抗性不同的自交系R15和掖478为材料，采用实时荧光定量PCR手段对上述两个材料中表达存在差异的成熟miRNA进行验证后发现，zmamiR165、zma-miR168b/zma-miR168b*、zma-miR171、zma-miR173、zma-miR319在玉米抗纹枯病胁迫过程中可能起重要的调控作用。

当植物受到病原物侵染时，体内多种miRNA及相关靶基因的表达量都会发生变化，说明miRNA在植物响应生物胁迫中发挥重要作用［65，66］，并且所介导的沉默途径、调控反应与病原抑制RNA沉默的反防御、干扰作用机制远比人们想象的复杂［53］。

3.2 植物非生物胁迫相关miRNA

3.2.1 养分胁迫 氮是植物3大营养元素之一，对植物的生长发育起重要作用。研究发现，在氮素水平较低的情况下，一些miRNA的表达量会发生变化［67］。如2009年，Pant等［68］发现在氮胁迫条件下拟南芥miRl69家族受到抑制，而供氮正常的植株韧皮部汁液中存在大量的miRl69，说明miRl69可能是氮代谢中的长距离信号。Joshi和Combier等［69，70］研究发现，豆科植物在低氮水平下，miR169通过调节根瘤发育适应低氮环境，原因是miR169的靶基因HAP2-1调控根瘤原基分化，过量表达miR169或敲除HAP2-1基因抑制侧根的形成。Gifford等［71］发现miR167a可以通过调节侧根生长来响应低氮胁，因为ARF8与植物侧根的生长有密切关系，而miR167a在低氮胁迫下表达量上调，从而导致靶基因ARF8表达下调。最近的研究表明，低N条件会引起水稻体内miRNAs含量的变化，如根部miR168表达水平下降［72］。

近年来，土壤有效磷的缺失已经成为很多地区限制作物生长的重要因素之一。植物在长期的进化过程中，通过改变根系形态结构、根系分泌有机酸和酸性磷酸酶分解根际难溶性磷，以增加与土壤的接触面积，提高植物体内磷的循环利用，以适应低磷环境［73］。这些适应性变化与低磷胁迫下某些特定基因的表达和调控密切相关［74］。Fujii等［11］发现，在拟南芥基因组中存在编码6个miR399基因，均在低磷胁迫的诱导下出现差异表达。拟南芥miR399对低磷胁迫发生响应，并保持体内磷素稳定平衡有重要作用［75］。植物在低磷胁迫下，miR399的表达量上升迅速，当磷素水平恢复正常时，表达量又急剧下降。Chio等［76］的研究表明，miR399的靶基因是无机磷转运子（Pi transporter）和泛素结合酶（UBC24）两个基因家族。Wang等［77］利用基因芯片得到199个陆地棉miRNA，通过对miR399研究发现，它与纤维中磷的含量变化相关。近年来的研究发现，除miR399之外，在其他植物中也有与磷相关的miRNA参与调节植物对磷胁迫的响应过程，如在大豆中miR159a在磷胁迫诱导下表达量上调，而miR166a、miR319a、miR396a、miR398b和miR1507a表达量上调［78］。

植物在应对低硫胁迫时，通过改变一些生理状态来使体内硫素水平维持稳态［53］。Sunkar等［79］研究发现miRNA395在维持拟南芥体内硫素平衡中发挥了重要作用。Lappartient等［80］研究发现，在拟南芥基因组中的两个基因簇的6个基因位点可能是miRNA395发挥作用的位点，其中APS1、APS3和APS4等是催化硫吸收的ATP硫化酶基因。AsT68则是一个低亲和力硫转运子，其主要作用是将硫由根系转运至茎叶［81］。Jones-rhoades等的研究结果表明，植物在受低硫胁迫诱导的同时，APS1的转录水平下降，当供硫正常时，ASP1的转录水平增加，miRNA395表达完全受到抑制［12］，表明可能存在某些负调控途径，但详细的调控机制还有待进一步研究。

miRNA对于微量元素及其他重金属元素有相似应对大量元素变化的调控功能［67］。在植物保守miRNA家族中，miR398在多种逆境胁迫响应中的调控功能已得到广泛研究，其在调节植物铜代谢平衡，应答过量的铁、镉等金属胁迫中扮演重要角色［82］。铜素缺乏时，miR398介导了Cu/Zn SOD mRNA的降解过程，促使CSD基因表达量下调，并且使CSD在叶绿体中的作用被Fe SOD所代替，该过程被认为是植物自身应对铜素缺乏的适应性变化［83］。

3.2.2 干旱胁迫 干旱是限制植物生长发育的重要因素之一。水稻miR169g家族包含17个成员，是在水稻中最早发现的与干旱相关的miRNA［84］。通过PEG6000模拟的干旱胁迫诱导水稻miR169和miR393的表达发现，miR169g是唯一一个被干旱所诱导的miR169成员，说明在序列相似的同一家族各成员之间，在生理学上有不同的作用。对拟南芥进行干旱胁迫时测定miR169a和miR169c的表达，发现过量表达miR169a的植株比野生型更容易表现出叶片易失水和抗干旱能力减弱等特点［84］。颜秦峰等［85］通过构建拟南芥MIR398过表达载体，将拟南芥MIR398基因转入烟草中后发现，在干旱胁迫下与野生型相比，转基因烟草丙二醛与超氧阴离子含量均有所升高，脯氨酸含量相对降低，说明了miR398参与了植物抗旱过程。罗书芳等［86］利用定量PCR技术验证了在干旱胁迫条件下，丹参中15种常见的miRNAs的差异表达，对其靶基因及其功能进行初步分析后发现，15种miRNA在干旱胁迫前后的表达都出现差异，推测出丹参miR169和miR3462参与丹参的干旱胁迫应答过程的可能性大。Wei等［87］通过miRNA芯片杂交实验发现，在干旱胁迫下来自13个物种的34个miRNA表达显著变化。在干旱条件下，miR474表达量上升，其靶基因PDH是脯氨酸积累过程的负调控元件。干旱胁迫抑制miR168、miR528和miR167表达，它们各自的靶mRNA、MAPK、POD和PLD表达量上调，启动ABA诱导的气孔运动和抗氧化防御。Li等［88］研究发现与吸足水分的玉米种子相比，干旱种子中miR168表达量上调，说明miR168参与了种子体内的新陈代谢，进而调控了耐干旱胁迫过程。

3.2.3 低温胁迫 低温对植物的自然分布和栽培区域有重要的限制作用。植物miRNA对低温胁迫作出响应是通过调控生长素、脱落酸（ABA）等信号途径完成的。研究发现，在低温胁迫下，拟南芥miR393表达上调，E3水解其靶蛋白受到抑制，进而使植物对低温的耐受性得到加强［53］。Sunkar等将拟南芥幼苗进行不同胁迫处理发现，miR393和miR397在低温胁迫诱导下表达。同时，一种miRNA可以在多种胁迫因素诱导下表达。例如，miR393受低温、脱水、高盐和ABA的正调控程度大，而miR397b和miR402受以上4种胁迫的正调控程度较小［5］。Zhou等和Liu等［89］分别通过全基因组测序及芯片杂交方法证实低温诱导miR397的表达。通过芯片杂交实验还证明低温诱导拟南芥miR172、miR171、miR169、miR408以及毛白杨中miR168和miR477的表达，同时抑制毛白杨miR156、miR475和miR476的表达。王冰等［90］对受低温胁迫诱导的小麦miR156家族成员进行了qRT-PCR分析后发现，miR156d*表现出明显下调趋势，miR156a的表达显著上升，说明它们参与了低温胁迫调控网络。

3.2.4 盐及其他非生物胁迫 除上述几种胁迫之外，植物在生长过程中可能还会受到盐、重金属、淹水、机械力、氧化和辐射等不同形式的非生物胁迫。植物在对这些胁迫作出适应性反应时，miRNA对生理活动的调节也有十分重要的意义。

Yin等［91］对耐盐性不同的两个棉花品种进行了盐胁迫处理，利用微阵列分析发现，miRNA在不同的耐盐性品种之间的特异性表达模式，确定了17个保守的棉花miRNA，耐盐品系在高盐胁迫下，miR156a/d/e、miR169、miR535a/b和miR827b表达量下调，miR167a、miR397a/b和miR399a表达上调，而盐敏感品系在盐胁迫下只有miR159表达量下调。预测其靶基因，并对靶基因功能相似性分析后发现，其靶基因包括转录因子和多种酶，调控植物生长和发育，保守的miRNA构成的复杂的调控网络，促进了棉花对盐胁迫的适应。杜驰等［92］在花花柴中克隆到CSD1和CSD2基因全长序列：KcCSD1和KcCSD2，进行盐胁迫诱导后，荧光定量PCR检测结果表明花花柴的KcmiR398和KcCSD1、KcCSD2存在组织差异性表达，说明盐胁迫可以影响KcmiR398和KcCSD1、KcCSD2基因的表达以适应盐胁迫产生的氧化危害。

Fang等［93］对HX3（Cd耐受型）和ZH24（Cd敏感型）大豆（Glycinemax）株系进行Cd对照处理，采用miRNA微阵列芯片鉴定出26个与Cd应激相关的miRNA，其中有5个和12个miRNA分别在HX3和ZH24中特异表达，9个miRNA在2个株系中均有发现。Yang和Chen等［94］研究发现，miR395在植物中参与调控硫饥饿诱导的低亲和力硫酸盐转运体（SULTR2；1）以及3个ATP硫酸化酶基因（ATP sulphurylase，APS）（APS1、APS3和APS4），从而参与重金属Al、Cd和Hg胁迫应答过程。Zhang等［95］通过对甘蓝型油菜的研究发现，miR395通过调控其靶基因APS和SULTR2的表达，参与Cd胁迫调节。

Zhang等［96］通过对玉米在淹水胁迫下miRNA调节根细胞形态及代谢作用的研究发现，在淹水胁迫下多种miRNA表达量出现差异，并呈现出动态性及多样性。Lu等［97，98］发现从机械力胁迫4 d的毛白杨（Populus trichocarpa）中分离得到的22个miRNAs，其中至少10个是毛白杨特有。通过对其靶基因预测并进行分析后发现，大部分miRNA的靶基因是与胁迫相关的抗性蛋白基因或者与细胞壁代谢合成有关的基因。

同时，植物在生长过程中会遇到多种胁迫的共同作用，植物在应对环境的综合胁迫时，同一种miRNA会对不同生理活动作出调节。Sunkar等对拟南芥幼苗进行脱水、高盐、低温和ABA胁迫处理后，构建了小分子RNA文库，对文库的测序结果进行分析后发现了来源于15个新的miRNA家族的26个新的miRNAs。利用miRNA与靶基因结合序列互补的特点，预测了41个具有不同功能的靶基因。Nothern分析后发现，许多miRNA受到一种或多种逆境胁迫的调控，并表现组织特异性。

4 展望

miRNA的发现是RNA研究领域的一个里程碑式的突破，植物逆境miRNA对研究植物在逆境胁迫下的适应性生理反应机制提供了强有力的工具，促进了对植物逆境分子生物学研究。目前虽然在很多物种中发现、鉴定了数以千计的miRNA，但是这些只占基因组中全部miRNA的一小部分，还有很多重要的miRNA等待人们去发现、研究、验证。然而大部分miRNA同时调控多种靶基因，各种miRNA构成的调控网存在交叉和关联，如何理清miRNA功能之间的复杂关系，需要依赖于更巧妙的试验设计和更先进的技术手段。解决逆境胁迫对作物生长和产量的限制问题，前提是弄清作物的抗胁迫机制，从miRNA的角度研究植物在逆境胁迫下的适应性变化，为作物抗逆境胁迫研究指明了新的方向，对作物种质资源的创新和抗胁迫新品种的培育有着重要的意义。

［1］ Knight H， Knight MR. Abiotic stress signalling pathways：specificity and cross-talk［J］. Trends in Plant Science， 2001， 6（6）：262-267.

［2］ Lee RC， Feinbaum RL， Ambros V. The C. elegans heterochronic gene lin-4 encodes small RNAs with antisense complementarity to lin-14［J］. Cell， 1993， 75（5）：843-854.

［3］Wightman B， Ha I， Ruvkun G. Posttranscriptional regulation of the heterochronic gene lin-14 by lin-4 mediates temporal pattern formation in C. elegans［J］. Cell， 1993， 75（5）：855-862.

［4］Reinhart BJ， Slack FJ， Basson M， et al. The 21-nucleotide let-7 RNA regulates developmental timing in Caenorhabditis elegans［J］. Nature， 2000， 403（6772）：901-906.

［5］ Sunkar R， Zhu JK. Novel and stress-regulated microRNAs and other small RNAs from Arabidopsis［J］. The Plant Cell Online， 2004， 16（8）：2001-2019.

［6］ Arazi T， Talmor-Neiman M， Stav R， et al. Cloning and characterization of micro-RNAs from moss［J］. The Plant Journal， 2005， 43（6）：837-848.

［7］ Sunkar R， Girke T， Jain PK， et al. Cloning and characterization of microRNAs from rice［J］. The Plant Cell Online， 2005， 17（5）：1397-1411.

［8］ Mica E， Gianfranceschi L， Pè ME. Characterization of five microRNA families in maize［J］. Journal of Experimental Botany， 2006， 57（11）：2601-2612.

［9］ Yao Y， Guo G， Ni Z， et al. Cloning and characterization of microRNAs from wheat（Triticum aestivum L.）［J］. Genome Biology， 2007， 8（6）：R96.

［10］ Mallory AC， Vaucheret H. Functions of microRNAs and related small RNAs in plants［J］. Nature Genetics， 2006， 38：S31-S36.

［11］ Fujii H， Chiou TJ， Lin SI， et al. A miRNA involved in phosphatestarvation response in Arabidopsis［J］. Current Biology， 2005， 15（22）：2038-2043.

［12］ Jones-rhoades MW， Bartel DP. Computational identification of plant microRNAs and their targets， including a stress-induced miRNA［J］. Molecular Cell， 2004， 14（6）：787-799.

［13］ Carrington JC， Ambros V. Role of microRNAs in plant and animal development［J］. Science， 2003， 301（5631）：336-338.

［14］ Lee Y， Kim M， Han J， et al. MicroRNA genes are transcribed by RNA polymerase II［J］. The EMBO Journal， 2004， 23（20）：4051-4060.

［15］ Lee YS， Nakahara K， Pham JW， et al. Distinct roles for Drosophila dicer-1 and dicer-2 in the siRNA/miRNA silencing pathways［J］. Cell， 2004， 117（1）：69-81.

［16］ Bartel DP. MicroRNAs：genomics， biogenesis， mechanism， and function［J］. Cell， 2004， 116（2）：281-297.

［17］ Kim YK， Kim VN. Processing of intronic microRNAs［J］. The EMBO Journal， 2007， 26（3）：775-783.

［18］ Kurihara Y， Watanabe Y. Arabidopsis micro-RNA biogenesis through Dicer-like 1 protein functions［J］. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America，2004， 101（34）：12753-12758.

［19］ Kim VN. MicroRNA biogenesis：coordinated cropping and dicing［J］. Nature Reviews Molecular Cell Biology， 2005， 6（5）：376-385.

［20］ Kurihara Y， Takashi Y， Watanabe Y. The interaction between DCL1 and HYL1 is important for efficient and precise processing of pri-miRNA in plant microRNA biogenesis［J］. Rna， 2006， 12（2）：206-212.

［21］ Vazquez F， Gasciolli V， Crété P， et al. The nuclear dsRNA binding protein HYL1 is required for microRNA accumulation and plant development， but not posttranscriptional transgene silencing［J］. Current Biology， 2004， 14（4）：346-351.

［22］ Lobbes D， Rallapalli G， Schmidt DD， et al. SERRATE：a new player on the plant microRNA scene［J］. EMBO Reports， 2006，7（10）：1052-1058.

［23］ Boutet S， Vazquez F， Liu J， et al. Arabidopsis HEN1：A genetic link between endogenous miRNA controlling development and siRNA controlling transgene silencing and virus resistance［J］. Current Biology， 2003， 13（10）：843-848.

［24］ Vaucheret H， Vazquez F， Crété P， et al. The action of ARGONAUTE1 in the miRNA pathway and its regulation by the miRNA pathway are crucial for plant development［J］. Genes & Development，2004， 18（10）：1187-1197.

［25］ Chan SP， Slack FJ. Point of VIEw microRNA-mediated silencing inside P-bodies［J］. RNA Biology， 2006， 3（3）：97-100.

［26］ Axtell MJ， Snyder JA， Bartel DP. Common functions for diverse small RNAs of land plants［J］. The Plant Cell Online， 2007， 19（6）：1750-1769.

［27］ Axtell MJ， Bartel DP. Antiquity of microRNAs and their targets in land plants［J］. The Plant Cell Online， 2005， 17（6）：1658-1673.

［28］ Ricci EP， Limousin T， Soto-Rifo R， et al. Activation of a microRNA response in trans reveals a new role for poly（A）in translational repression［J］. Nucleic Acids Research， 2011， 39（12）：5215-5231.

［29］ Cullen BR. Derivation and function of small interfering RNAs and microRNAs［J］. Virus Research， 2004， 102（1）：3-9.

［30］ Baker CC， Sieber P， Wellmer F， et al. The early extra petals1 Mutant uncovers a role for microRNA miR164c in regulating petal number in Arabidopsis［J］. Current Biology， 2005， 15（4）：303-315.

［31］ Pfeffer S， Lagos-Quintana M， Tuschl T. Cloning of small RNA molecules［OL］//Current Protocols in Molecular Biology，2005， DOI： 10.1002/0471142727.mb2604s72.

［32］ Zuker M. Mfold web server for nucleic acid folding and hybridization prediction［J］. Nucleic Acids Research， 2003， 31（13）：3406-3415.

［33］ Berninger P， Gaidatzis D， Van Nimwegen E， et al. Computational analysis of small RNA cloning data［J］. Methods， 2008， 44（1）：13-21.

［34］ Reinhart BJ， Weinstein EG， Rhoades MW， et al. MicroRNAs inplants［J］. Genes & Development， 2002， 16（13）：1616-1626.

［35］ Llave C， Kasschau KD， Rector MA， et al. Endogenous and silencing-associated small RNAs in plants［J］. The Plant Cell Online， 2002， 14（7）：1605-1619.

［36］ Chen K， Rajewsky N. The evolution of gene regulation by transcription factors and microRNAs［J］. Nature Reviews Genetics， 2007， 8（2）：93-103.

［37］ Palatnik JF， Allen E， Wu X， et al. Control of leaf morphogenesis by microRNAs［J］. Nature， 2003， 425（6955）：257-263.

［38］ Mallory AC， Bouché N. MicroRNA-directed regulation：to cleave or not to cleave［J］. Trends in Plant Science， 2008， 13（7）：359-367.

［39］ Jover-Gil S， Candela H， Ponce M. Plant microRNAs and development［J］. International Journal of Developmental Biology， 2005， 49（5/6）：733.

［40］ Fahlgren N， Howell MD， Kasschau KD， et al. High-throughput sequencing of Arabidopsis microRNAs：evidence for frequent birth and death of MIRNA genes［J］. PloS One， 2007， 2（2）：e219.

［41］ Adai A， Johnson C， Mlotshwa S， et al. Computational prediction of miRNAs in Arabidopsis thaliana［J］. Genome Research， 2005，15（1）：78-91.

［42］ Billoud B， De Paepe R， Baulcombe D， et al. Identification of new small non-coding RNAs from tobacco and Arabidopsis［J］. Biochimie， 2005， 87（9）：905-910.

［43］ Yin Z， Li C， Han X， et al. Identification of conserved microRNAs and their target genes in tomato（Lycopersicon esculentum）［J］. Gene， 2008， 414（1）：60-66.

［44］ Xu Y， Zhou X， Zhang W. MicroRNA prediction with a novel ranking algorithm based on random walks［J］. Bioinformatics，2008， 24（13）：i50-i58.

［45］ Kauppinen S， Havelda Z. Detection of siRNAs and miRNAs［M］// Plant Virology Protocols. Springer， 2008：217-227.

［46］ Arora A， Mckay GJ， Simpson DAC. Prediction and verification of miRNA expression in human and rat retinas［J］. Investigative Ophthalmology & Visual Science， 2007， 48（9）：3962-3967.

［47］ Lai EC. Predicting and validating microRNA targets［J］. Genome Biology， 2004， 5（9）：115.

［48］ Sunkar R， Kapoor A， Zhu JK. Posttranscriptional induction of two Cu/Zn superoxide dismutase genes in Arabidopsis is mediated by downregulation of miR398 and important for oxidative stress tolerance［J］. The Plant Cell Online， 2006， 18（8）：2051-2065.

［49］ Du TT， Fu YF， Dong M， et al. Experimental validation and complexity of miRNA-mRNA target interaction during zebrafish primitive erythropoiesis［J］. Biochemical and Biophysical Research Communications， 2009， 381（4）：688-693.

［50］ Addo-Quaye C， Miller W， Axtell MJ. CleaveLand：a pipeline for using degradome data to find cleaved small RNA targets［J］. Bioinformatics， 2009， 25（1）：130-131.

［51］ Fowler S， Thomashow MF. Arabidopsis transcriptome profiling indicates that multiple regulatory pathways are activated during cold acclimation in addition to the CBF cold response pathway［J］. The Plant Cell Online， 2002， 14（8）：1675-1690.

［52］ Zhu JK. Salt and drought stress signal transduction in plants［J］. Annual Review of Plant Biology， 2002， 53（1）：247-273.

［53］ 沈亚欧， 林海建， 张志明， 等. 植物逆境miRNA研究进展［J］.遗传， 2009， 31（3）：227-235.

［54］ 彭建斐， 戴良英， 何玉科， 等. 水稻微小RNA研究进展［J］.湖南农业科学， 2010（15）：4-6， 10.

［55］ Dunoyer P， Lecellier CH， Parizotto EA， et al. Probing the microRNA and small interfering RNA pathways with virus-encoded suppressors of RNA silencing［J］. The Plant Cell Online， 2004， 16（5）：1235-1250.

［56］ Saumet A， Lecellier CH. Anti-viral RNA silencing：do we look like plants？［J］. Retrovirology， 2006， 3（1）：3.

［57］ Feng J， Wang K， Liu X， et al. The quantification of tomato microRNAs response to viral infection by stem-loop real-time RTPCR［J］. Gene， 2009， 437（1）：14-21.

［58］ Chellappan P， Vanitharani R， Fauquet CM. MicroRNA-binding viral protein interferes with Arabidopsis development［J］. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America， 2005， 102（29）：10381-10386.

［59］ 孙广鑫， 栾雨时， 崔娟娟. 番茄中与致病密切相关miRNA的挖掘及特性分析［J］. 遗传， 2014（1）：69-76.

［60］ Zhang W， Gao S， Zhou X， et al. Bacteria-responsive microRNAs regulate plant innate immunity by modulating plant hormone networks［J］. Plant Molecular Biology， 2011， 75（1-2）：93-105.

［61］ Yin Z， Li Y， Han X， et al. Genome-wide profiling of miRNAs and other small non-coding RNAs in the Verticillium dahliae-inoculated cotton roots［J］. PloS One， 2012， 7（4）：e35765.

［62］ Feng BH， Yang Y， Shi YF， et al. Characterization and genetic analysis of a novel rice spotted-leaf mutant HM47 with broadspectrum resistance to Xanthomonas oryzae pv. oryzae［J］. Journal of Integrative Plant Biology， 2013， 55（5）：473-483.

［63］ 姜兆远， 任金平， 刘晓梅， 等. 稻瘟病菌胁迫下水稻miRNA的表达［J］. 安徽农业科学， 2013（17）：7410-7412， 7417.

［64］ 罗茂， 彭华， 宋锐， 等. 玉米纹枯病胁迫相关miRNA功能研究［J］. 作物学报， 2013（05）：837-844.

［65］ Gal-On A， Kaplan I， Palukaitis P. Differential effects of satellite RNA on the accumulation of cucumber mosaic virus RNAs and their encoded proteins in tobacco vs zucchini squash with two strains of CMV helper virus［J］. Virology， 1995， 208（1）：58-66.

［66］ Diermann N， Matoušek J， Junge M， et al. Characterization of plant miRNAs and small RNAs derived from potato spindle tuber viroid（PSTVd）in infected tomato［J］. Biological Chemistry， 2010，391（12）：1379-1390.

［67］ Chiou TJ. The role of microRNAs in sensing nutrient stress［J］. Plant， Cell & Environment， 2007， 30（3）：323-332.

［68］ Pant BD， Musialak-Lange M， Nuc P， et al. Identification of nutrientresponsive Arabidopsis and rapeseed microRNAs by comprehensive real-time polymerase chain reaction profiling and small RNA sequencing［J］. Plant Physiology， 2009， 150（3）：1541-1555.

［69］ Joshi T， Yan Z， Libault M， et al. Prediction of novel miRNAs and associated target genes in Glycine max［J］. BMC Bioinformatics，2010， 11（Suppl 1）：S14.

［70］ Combier JP， Frugier F， De Billy F， et al. MtHAP2-1 is a key transcriptional regulator of symbiotic nodule development regulated by microRNA169 in Medicago truncatula［J］. Genes & Development， 2006， 20（22）：3084-3088.

［71］ Gifford ML， Dean A， Gutierrez RA， et al. Cell-specific nitrogen responses mediate developmental plasticity［J］. Proceedings of the National Academy of Sciences， 2008， 105（2）：803-808.

［72］ Nischal L， Mohsin M， Khan I， et al. Identification and comparative analysis of microRNAs associated with low-N tolerance in rice genotypes［J］. PloS One， 2012， 7（12）：e50261.

［73］ Roghothama KG， Karthikeyan AS. Phosphate acqiucition［J］. Plant and Soil， 2005， 274（1-2）：37-49.

［74］ Bari R， Pant BD， Stitt M， et al. PHO2， microRNA399， and PHR1 define a phosphate-signaling pathway in plants［J］. Plant Physiology， 2006， 141（3）：988-999.

［75］ Aung K， Lin SI， Wu CC， et al. pho2， a phosphate overaccumulator，is caused by a nonsense mutation in a microRNA399 target gene［J］. Plant Physiology， 2006， 141（3）：1000-1011.

［76］ Chiou TJ， Aung K， Lin SI， et al. Regulation of phosphate homeostasis by microRNA in Arabidopsis［J］. The Plant Cell Online， 2006， 18（2）：412-421.

［77］ Wang G， 余道乾， 杜雄明. 陆地棉种子发育过程中microRNA的挖掘与功能研究［J］. 棉花学报， 2014（1）：81-86.

［78］ Zeng HQ， Zhu YY， Huang SQ， et al. Analysis of phosphorusdeficient responsive miRNAs and cis-elements from soybean（Glycine max L.）［J］. Journal of Plant Physiology， 2010， 167（15）：1289-1297.

［79］ Sunkar R， Chinnusamy V， Zhu J， et al. Small RNAs as big players in plant abiotic stress responses and nutrient deprivation［J］. Trends in Plant Science， 2007， 12（7）：301-309.

［80］ Lappartient AG， Vidmar JJ， Leustek T， et al. Inter-organ signaling in plants：regulation of ATP sulfurylase and sulfate transporter genes expression in roots mediated by phloem-translocated compound［J］. The Plant Journal， 1999， 18（1）：89-95.

［81］ Takahashi H， Watanabe-Takahashi A， Smith FW， et al. The roles of three functional sulphate transporters involved in uptake and translocation of sulphate in Arabidopsis thaliana［J］. The Plant Journal， 2000， 23（2）：171-182.

［82］ Siré C， Moreno AB， Garcia-Chapa M， et al. Diurnal oscillation in the accumulation of Arabidopsis microRNAs， miR167， miR168，miR171 and miR398［J］. FEBS Letters， 2009， 583（6）：1039-1044.

［83］ Yamasaki H， Abdel-Ghany SE， Cohu CM， et al. Regulation of copper homeostasis by micro-RNA in Arabidopsis［J］. Journal of Biological Chemistry， 2007， 282（22）：16369-16378.

［84］ Zhao B， Liang R， Ge L， et al. Identification of drought-induced microRNAs in rice［J］. Biochemical and Biophysical Research Communications， 2007， 354（2）：585-590.

［85］ 颜秦峰， 李科友， 石振楠， 等. 过表达miR398对烟草抗旱性的影响［J］. 北方园艺， 2013（13）：111-116.

［86］ 罗书芳， 崔浪军， 王健， 等. 干旱胁迫下15种丹参miRNAs差异表达分析［J］. 广东农业科学， 2013（5）：134-137.

［87］ Wei L， Zhang D， Xiang F， et al. Differentially expressed miRNAs potentially involved in the regulation of defense mechanism todrought stress in maize seedlings［J］. International Journal of Plant Sciences， 2009， 170（8）：979-989.

［88］ Li D， Wang L， Liu X， et al. Deep sequencing of maize small RNAs reveals a diverse set of microRNA in dry and imbibed seeds［J］. PloS One， 2013， 8（1）：e55107.

［89］ Liu HH， Tian X， Li YJ， et al. Microarray-based analysis of stressregulated microRNAs in Arabidopsis thaliana［J］. Rna， 2008， 14（5）：836-843.

［90］ 王冰， 宋娜， 孙燕飞， 等. MircoRNA156家族在小麦非生物胁迫中的表达分析［J］. 植物病理学报， 2013（2）：201-204.

［91］ Yin Z， Li Y， Yu J， et al. Difference in miRNA expression profiles between two cotton cultivars with distinct salt sensitivity［J］. Molecular Biology Reports， 2012， 39（4）：4961-4970.

［92］ 杜驰， 廖茂森， 张霞， 等. 盐胁迫下花花柴miR398对Cu/Zn超氧化物歧化酶基因的调控研究［J］. 西北植物学报， 2014（4）：682-688.

［93］ Fang X， Zhao Y， Ma Q， et al. Identification and comparative analysis of cadmium tolerance-associated miRNAs and their targets in two soybean genotypes［J］. PloS One， 2013， 8（12）：e81471.

［94］ Yang Z， Chen J. A potential role of microRNAs in plant response to metal toxicity［J］. Metallomics， 2013， 5（9）：1184-1190.

［95］ Zhang LW， Song JB， Shu XX， et al. miR395 is involved in detoxification of cadmium in Brassica napus［J］. Journal of Hazardous Materials， 2013（250-251）：204-211.

［96］ Zhang B， Pan X， Stellwag EJ. Identification of soybean microRNAs and their targets［J］. Planta， 2008， 229（1）：161-182.

［97］ Lu S， Sun YH， Shi R， et al. Novel and mechanical stress-responsive microRNAs in Populus trichocarpa that are absent from Arabidopsis［J］. The Plant Cell Online， 2005， 17（8）：2186-2203.

［98］ Lu S， Sun YH， Chiang VL. Stress-responsive microRNAs in Populus［J］. The Plant Journal， 2008， 55（1）：131-151.

（责任编辑 狄艳红）

Research Progress of MicroRNAs in Plant Stress Responses

Wang Wei Zhang Yujuan Chen Jie Liu Jubo Xia Minxuan Shen Fafu
（State Key Laboratory of Crop Biology，College of Agronomy，Shandong Agricultural University，Tai’an 271018）

MicroRNA（miRNAs）is a class of endogenous non-coding small RNAs， which participate in regulation of physiological activities by target mRNA cleavage or translational repression in plants. Some miRNAs play important roles in stress-related signal transduction and improving resilience against adverse environmental hazards of plant capacity by regulating gene expression under stressed conditions. This article focused on the production of miRNA， mechanism， research approaches and characteristics of resisting the biotic and abiotic stresses in plants， the development trends and future prospect of plant miRNAs research.

microRNA；stress；bioinformatics；target gene；gene regulation

2014-07-14

国家转基因育种重大专项（2011ZX08005-004，2011ZX08005-002）

王维，男，硕士，研究方向：植物生物技术及其在育种上的应用；E-mail：sdauww@126.com

沈法富，男，教授，研究方向：棉花种质资源创新；E-mail：ffshen@sdau.edu.cn