高羊茅黔草1 号SAMDC 基因的克隆及植物表达载体的构建

曾庆飞，杨春燕，李小冬，吴佳海，王小利

( 1． 贵州省草业研究所，贵州贵阳550006; 2． 贵州阳光草业科技有限责任公司，贵州贵阳550006)

S-腺苷甲硫氨酸脱羧酶基因(SAMDC)是一个在植物生长发育过程中起着重要作用的抗逆相关基因［1-3］。SAMDC 是植物多胺生物合成途径中的一个关键酶，该酶以S-腺苷甲硫氨酸(SAM)为底物催化形成脱羧S-腺苷甲硫氨酸(dcSAM)，为精氨和亚精氨的合成提供氨丙基，是亚精胺和精胺合成的限速酶［4］。迄今为止，已从生菜(Lactuca sativa)、康乃馨(Dianthus caryophyllus)、拟南芥(Arabidopsis thaliana)、大豆(Glycine max)、水稻(Oryza sativa)、芥菜型油菜(Brassica juncea)、番茄(Lycopersicon esculentum)等植物中克隆出SAMDC 编码基因［5］。

通过超量表达SAMDC 基因来提高农作物的抗盐、抗高温、抗旱性研究在国外已有不少成功的先例。Bhavna 和Manchikatla［6］将人类SAMDC 基因导入烟草(Nicotiana tabacum)，烟草内源腐胺和亚精胺含量显著升高，植物耐盐性和渗透性提高。Cheng等［7］将酵母SAMDC 基因转入番茄，转基因植株亚精胺和精胺含量升高，且植株对高温胁迫表现明显抗性。Momtaz 等［8］将酵母的SAMDC 基因通过基因枪法转化茎尖导入棉花(Gossypium hirsutum)Giza88和Giza90，发现转基因植株中精胺水平显著提高，耐旱性增强。Zhao 等［9］通过融合GUS 蛋白对Md-SAMDC2 启动子进行定位分析和逆境胁迫诱导表达分析，GUS 活性在盐和低温胁迫下上升表达，表明SAMDC 启动子控制着逆境条件下的基因表达。

在国内，李昌澎等［10］以小麦(Triticum aestivum)品种“晋麦47”为材料，利用半定量RT-PCR方法，对SAMDC 基因在正常供水、PEG-6000 模拟水分胁迫和复水过程中小麦叶片的表达模式进行了分析。结果表明，小麦SAMDC 基因的表达受水分胁迫诱导。同时，SAMDC 基因还参与水分胁迫后的复水调节，说明S-腺苷甲硫氨酸代谢途径在小麦抗旱节水中具有重要作用。陆俊杏等［11］对甘蓝型油菜(Brassica napus)的SAMDC3 基因及其启动子进行了克隆分析，表明SAMDC3 可能通过ABA、6-BA 和SA 信号途径介导植物对非生物胁迫的响应。众多研究已证实SAMDC 是参与抗旱响应和受盐胁迫诱导的抗逆功能基因，植物SAMDC基因的研究与利用正逐渐受到重视［6］。本研究克隆了贵州省草业研究所自主育成的高羊茅新品种“黔草1 号”(Festuca arundinacea cv． Qiancao No．1)的SAMDC 基因，并针对高羊茅和黑麦草(Lolium perenne)组培再生系统对特定抗生素的敏感特性，构建了适合于单子叶禾本科牧草特别是高羊茅和黑麦草遗传转化的植物过量表达载体，以期通过下一步的遗传转化培育出禾草抗逆种质新材料。

1 材料与方法

1．1 材料

1．1．1 植物材料 高羊茅“黔草1 号”由贵州省草业研究所于2005 年育成并保存。

1．1．2 菌株和质粒 大肠杆菌(Escherichia coli)DH5α、JM109 购自TAKARA 公司，农杆菌GV3101、EHA105 和改造过的pCAMBIA1300 载体由贵州省农业科学院草业研究所分子生物学实验室保存。

1．1．3 酶和化学试剂 植物总RNA 提取试剂盒、pGM-T 平末端DNA 片段加A 试剂盒购自天根生化科技(北京)有限公司;cDNA 合成试剂盒购自Clontech 公司;限制性内切酶、T-DNA 连接酶购自Thermo Scientific 公司;DNA 片段回收试剂盒、潮霉素、卡那霉素、氨苄青霉素等购自生工生物工程(上海)股份有限公司;其他试剂均为分析纯。

1．2 试验方法

1．2．1 高羊茅总RNA 的提取及cDNA 的合成 高羊茅“黔草1 号”叶片总RNA 的提取按照天根公司的总RNA 提取试剂盒操作步骤进行;以提取的RNA 为模板，按照Clontech cDNA 扩增试剂盒的操作说明合成cDNA 第一链。

1．2．2 目的基因的克隆与序列分析 根据Gen-Bank 上所登录的高羊茅SAMDC 基因序列，采用Primer Premier 5 软件设计一对引物FaSF/R，用于扩增高羊茅SAMDC 基因的全长CDS。并根据载体pCAMBIA1300 的结构特点，在引物的5'端分别加上KpnI 和PstI 酶切位点，引物序列为，FaSFwd1:5'-CGGGGTACCAAAATCCGTAAACTCGTCG-3'; FaSRev1: 5'-ACGCTGCAGCCTAGAGCCAACAATAGTTTAT-3'。

扩增产物大小为1 821 bp。以高羊茅“黔草1号”cDNA 为模板，用FaSF/R 引物扩增高羊茅SAMDC 基因的全长CDS。PCR 反应采用Thermo Fisher公司的Thermo Scientific Phusion 高保真DNA 聚合酶进行扩增。通过平末端DNA 片段加A 试剂盒在纯化的PCR 产物3'末端加A 后与pGM-T 连接，得到pGM-T-FaSAMDC 重组质粒，通过热激法将质粒转入大肠杆菌DH5α 中，挑选阳性克隆送大连宝生物有限公司测序。

1．2．3 SAMDC 基因表达载体的构建

1)酶切反应:在一灭菌的EP 管中依次加入10 ×Tango Buffer 2 μL、改造后的pCAMBIA1300 或pGM-T-FaSAMDC 15 μL、KpnI 2 μL、PstI 1 μL，轻轻混匀，瞬时离心，37 ℃水浴3 h，60 ℃灭活15 min 终止反应。琼脂糖凝胶电泳，DNA 片段回收试剂盒回收目的片段。

2)连接反应:在一灭菌的EP 管中依次加入经双酶切后回收的pCAMBIA1300 2 μL、经双酶切后回收的FasAMDC 8 μL、灭菌去离子水7 μL、10 ×连接Buffer 2 μL，45 ℃水浴5 min 后加入T4-DNA 连接酶1 μL，混匀于16 ℃条件下过夜。

3)转化及鉴定:取10 μL 连接产物转化JM109感受态细胞，涂布于含氨苄青霉素的LB 琼脂平板上，挑选阳性单菌落于LB 液体培养基中，37 ℃培养过夜，少量抽提质粒，用PCR 及双酶切进行鉴定。

1．2．4 根癌农杆菌重组质粒的导入 取5 μL pCAM-SAMDC 过表达载体，分别加入200 μL 根癌农杆菌GV3101 和EHA105 感受态细胞中，混匀，冰浴15 min;转入液氮冷冻l min，迅速置37 ℃水浴锅温浴5 min;加入400 μLYEB 液体培养基，28 ℃250 r·min－1预表达4 ～5 h;取适当体积均匀涂布于含有抗生素的YEB 平板，28 ℃培养2 d，待长出单菌落后挑取单克隆，扩大培养后提取质粒，并进行PCR 和酶切验证，将阳性克隆加15%的甘油置于－70 ℃冰箱中保存。

2 结果

2．1 目的片段的克隆与序列分析

2．1．1 FaSAMDC 基因cDNA 片段的扩增与回收

以反转录合成的高羊茅“黔草1 号”cDNA 为模板，利用设计合成的引物FaSFwd1 和FaSRev1 进行PCR 扩增，得到预期约1 821 bp 的条带(图1)，采用DNA 胶回收试剂盒纯化回收PCR 产物。

图1 高羊茅“黔草1 号”的SAMDC 基因扩增Fig．1 Amplification of SAMDC geng from Qiancao No． 1

2．1．2 基因的克隆与序列分析 通过平末端DNA片段加A 试剂盒在纯化的PCR 产物3'末端加A 后与pGM-T 连接，得到pGM-T-FaSAMDC 重组质粒，通过热激法将质粒转入大肠杆菌DH5α 中，挑选阳性克隆送大连宝生物有限公司测序。基因测序分析表明，包括引物的扩增片段共1 835 个核苷酸，包含有9 bp 的微型上游阅读框、147 bp 的小型上游阅读框和1 185 bp 的主阅读框。微型上游阅读框和小型上游阅读框存在一个碱基重叠。整个克隆片段与GenBank 上公布的高羊茅SAMDC 基因的核苷酸同源性为95．05%。

2．1．3 克隆基因氨基酸序列的推导与分析 采用DNAMAN 软件推导得出，扩增的SAMDC 基因主阅读框编码395 个氨基酸，与GenBank 登录的FaSAMDC 基因编码的氨基酸数量相同，同源性为98．22%，说明克隆的“黔草1 号”的SAMDC 基因与注册的高羊茅FaSAMDC 基因存在着微小的差异。

2．2 SAMDC 基因植物表达载体的构建

根据克隆出的FaSAMDC 基因核苷酸的序列特征，选择经贵州省草业研究所分子生物学实验室改造后的pCAMBIA 1300 作为表达载体。用KpnI 和PstI 双酶切pGM-T-FaSAMDC 重组质粒，回收1．8 kb的SAMDC 基因片段，与经KpnI 和PstI 双酶切回收的pCAMBIA 1300 大片段连接，获得重组质粒pCAM-SAMDC。

用重组质粒转化JM109 感受态细胞，挑选阳性克隆培养抽提质粒，以提取的重组质粒为模板，采用与扩增FaSAMDC 基因相同的引物和体系进行PCR 鉴定，结果扩出了1．8 kp 的目的片段(图2);用KpnI 和PstI 双酶切重组质粒pCAM-SAMDC，得到8．9 和1．8 kb 的两条片段(图3)，说明pCAM-SAMDC 为本文需要的过表达载体，接下来重组质粒部分序列的测定结果进一步证明了表达载体构建的正确性。构建出的过表达载体结构如图4 所示。

图2 重组质粒的PCR 鉴定Fig．2 Identification of recombinant plasmids with PCR

图3 重组质粒的酶切鉴定Fig．3 Analysis of recombinant plasmid with restriction enzyme

2．3 重组质粒导入农杆菌株

通过冻融法将构建的重组质粒pCAM-SAMDC导入根癌农杆菌GV3101 和EHA105 菌株中，提取2个转化后的根癌农杆菌菌株的质粒，经PCR 扩增都获得了1．8 kb 的目的片段(图5)，证明构建的过表达载体已成功转入农杆菌菌株中，为下一步通过农杆菌介导法将SAMDC 基因导入禾本科牧草奠定了基础。

图4 构建的植物表达载体结构简图Fig．4 The structural diagram of constructed plant expression vector

图5 农杆菌转化菌株的PCR 鉴定Fig．5 Identification of transmitted Agrobacterium tumefacien strains with PCR

3 讨论与结论

高羊茅、黑麦草等草种是世界上广泛栽培的重要冷季型禾草，在我国很多地区被大量引进种植，其株型外观优美，植株营养丰富、耐践踏，具有作为牧草和草坪草的很多优点，但在草地草坪建植过程中也存在着一些缺点，如不耐高温、干旱及高盐等非生物胁迫［12］，通过转入可利用的抗性基因来提高它们的抗性具有重要的生产意义。

S-腺苷甲硫氨酸脱羧酶基因(SAMDC)是一个在植物多胺合成途径中起着重要调节作用的抗逆相关基因。SAMDC 基因表达受高盐、高热、干旱及寒冷的诱导，但不受植物创伤的影响，说明SAMDC 能对多种环境条件的胁迫作出反应［13］。Wi 等［14］在烟草中过量表达康乃馨的SAMDC 能让转基因植株获得对非生物胁迫的广谱抗性;Peremarti 等［15］研究证明，SAMDC 调节合成的精胺积累有助于植物在经受干旱后的快速复苏;Hazarika 和Rajam［16］的试验还证明，转基因番茄中SAMDC 基因的组成型表达同时提高了植株对生物及非生物胁迫的耐受性。Lasanajak 等［17］将酵母SAMDC 基因转入番茄，结果在果实中观察到多胺生物合成流量的增加，而乙烯的生成减少。Wi 等［18］最近发现，除调节多胺的生物合成外，SAMDC 还能通过抑制活性氧的积累来增强拟南芥对干旱的耐受性。

植物的SAMDC 基因存在着序列结构的多态性。本研究从高羊茅“黔草1 号”叶片中扩增SAMDC 基因时，采用高保真DNA 聚合酶平末端扩增法，以最大程度降低碱基的错配率。克隆出的SAMDC基因包括引物序列共有1 835 个核苷酸，包含有9 bp 的微型上游阅读框、147 bp 的小型上游阅读框和1 185 bp 的主阅读框，微型上游阅读框和小型上游阅读框存在一个碱基重叠，这与葡萄(Vitis vinifera)、马铃薯(Solanum tuberosum)、大豆中的SAMDC基因上游阅读框的结构特征相同。Tassoni 等［3］将去除上游2 个微小读码框的葡萄SAMDC cDNA 片段导入酵母细胞内表达，结果显示SAMDC 酶的活性比完整片段的酶活性要高出50 倍之多，说明SAMDC 基因上游的2 个微小读码框具有很强的调节功能。本研究克隆出的高羊茅“黔草1 号”SAMDC 基因主阅读框编码395 个氨基酸，这与GenBank登录的FaSAMDC 基因编码的氨基酸数量一致，但与大豆GmSAMDC1 基因编码355 个氨基酸的片段长度差异较大［13］。

本研究构建SAMDC 基因植物表达载体的目的是针对黑麦草和高羊茅的遗传转化。高羊茅与黑麦草的胚性愈伤组织对卡那霉素、头孢霉素等抗生素较为敏感，选用潮霉素作为筛选抗生素能明显提高阳性株系的出苗率［19-20］。本研究选择经贵州省草业研究所分子生物学实验室改造过的pCAMBIA1300 作为表达载体，一方面，能将插入的SAMDC 基因直接置于35S 启动子之下，另一方面，可用潮霉素作为遗传转化时的筛选抗生素，以增加转基因株系的获得率。成功构建的pCAM-SAMDC 过表达载体，为下一步通过遗传转化手段培育黑麦草和高羊茅的抗旱、耐热、耐盐新品系奠定了物质基础。

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