过氧化物酶体生物发生研究进展

孙 艳, 孙雪培, 姜玲玲, 石 芸

(河北医科大学 生物化学与分子生物学研究室， 河北 石家庄 050017)

过氧化物酶体生物发生研究进展

孙 艳, 孙雪培, 姜玲玲, 石 芸

(河北医科大学 生物化学与分子生物学研究室， 河北 石家庄 050017)

过氧化物酶体是存在于真核细胞中的一种亚细胞器, 主要功能是参与脂肪酸等脂质的代谢过程和氧化应激的调节。近年来研究发现, 多种疾病都与过氧化物酶体的生物发生异常有关。过氧化物酶体的生物发生指过氧化物酶体的形成过程, 包括从头合成和分裂增殖两条途径。两条途径中, 参与过氧化物酶体生物发生的蛋白质, 即peroxin (PEX)的基因发生突变, 会导致过氧化物酶体生成障碍, 引起疾病的发生。因此, 就过氧化物酶体生物发生的研究进展进行综述, 有助于为相关疾病的诊断和治疗提供参考和依据。

过氧化物酶体；peroxin；过氧化物酶体生物发生缺陷病

过氧化物酶体是存在于真核细胞中的一种亚细胞器, 呈圆形, 直径0.1～1 μm, 由单层膜包裹, 内含各种代谢酶类, 不含DNA成分, 其主要功能是参与脂质代谢, 如极长链脂肪酸(very long chain fatty acid, VLCFA)的分解代谢和缩醛磷脂、胆固醇等的合成代谢[1]。除此之外, 过氧化物酶体还能失活过氧化氢等毒性物质, 使细胞免受这些有毒物质的损害。如果细胞中过氧化物酶体的数量减少或完全缺失, 都会导致其功能异常而引起疾病的发生, 如神经退行性疾病、过氧化物酶体生物发生缺陷病(peroxisomal biogenesis disease, PBD)等。因此, 过氧化物酶体正常功能的发挥也依赖于其生物发生过程的正常进行。正是由于过氧化物酶体与疾病的这种密切关系, 使过氧化物酶体的生物发生成了近年研究的一个热点, 并取得了一定的进展, 本文对近些年过氧化物酶体生物发生的研究进展作一综述, 以期为相应疾病的深入研究提供参考和依据。

1 过氧化物酶体生物发生概述

过氧化物酶体的生物发生, 即过氧化物酶体的形成过程, 主要指过氧化物酶体单层膜的形成以及在膜基础上的各种蛋白质的正确组装。构成过氧化物酶体的蛋白质有两类: 膜蛋白(peroxisomal membrane protein, PMP)和基质蛋白。基质蛋白主要指位于过氧化物酶体基质中的各种酶蛋白, 而膜蛋白定位于过氧化物酶体的单层膜, 除了某些与过氧化物酶体功能相关的蛋白外, 还包括一类参与过氧化物酶体生物发生的蛋白质, 称为peroxin, 简写为PEX, 由核基因pex编码, 目前已发现30多种[1]。膜蛋白和基质蛋白, 只有正确组装在一起, 才能形成成熟的过氧化物酶体。

以往的观点认为, 过氧化物酶体与线粒体一样, 既然都参与脂质代谢, 在功能上有相似的地方, 那么, 过氧化物酶体的生物发生也应该与线粒体一样, 是由现有的过氧化物酶体分裂而来[2]。但近年的研究发现, 除了能通过自身的分裂来进行增殖, 即分裂增殖模式, 过氧化物酶体还能由内质网产生, 即先由内质网通过出芽的方式释放未成熟的囊泡状结构, 这种囊泡状结构称为过氧化物酶体前体, 然后, 过氧化物酶体前体再在胞质中装配为成熟的过氧化物酶体, 这种模式称为过氧化物酶体的从头合成。

2 过氧化物酶体的从头合成

用断层扫描技术对小鼠的树突状细胞进行三维重建后发现, 细胞中过氧化物酶体和内质网间存在膜的连续性, 表明过氧化物酶体可以来源于内质网[3]。过氧化物酶体的从头合成包括3个阶段: 膜蛋白在内质网膜上的整合、未成熟过氧化物酶体前体的形成以及基质蛋白向膜内的转运。

2.1 膜蛋白在内质网膜上的整合

Van der Zand[4]等用pex2、pex10等多种膜蛋白基因与黄色荧光蛋白(yellow fluorescent protein, YFP)基因融合而成的表达质粒转染酵母细胞后发现, 黄色荧光总是首先出现在内质网的特定区域, 约300 min后, 再出现在过氧化物酶体上。提示, 这些膜蛋白可能首先定位到内质网的特定区域, 然后从内质网脱落, 再进一步形成过氧化物酶体。表明膜蛋白在内质网膜上的整合应该是过氧化物酶体从头合成的第一步。

利用低等真核系统, 如酵母细胞, 研究PMP的结构特点及其与内质网膜定位的关系发现, 几乎所有的膜蛋白都包含一段内质网引导序列, 称为膜定位信号(peroxisomal membrane targeting signal, mPTS)。这段序列也可引导PMP定位于过氧化物酶体的单层膜。PMP通常通过跨膜结构结合于膜的脂质双分子层, 而mPTS多位于这些跨膜区暴露在腔侧的茎环结构中[5], 并含有由至少5个氨基酸组成的保守序列, 如啤酒酵母PEX3 mPTS的保守序列为RX-K/R-XK。这些保守序列是mPTS识别膜受体并与其结合的关键序列。

PMP在胞质游离核糖体合成后, 会在mPTS的引导下, 结合到内质网膜, 这个过程需要PEX3和PEX19等膜蛋白的介导。在pex19缺失的酵母细胞, 用细胞免疫荧光检测技术观察荧光标记的各种膜蛋白的定位情况发现, 多数PMP均不能正确定位到内质网, 但PEX3和PEX22却不受影响; 而过表达PEX19后, 这些原本不能正确定位到内质网的PMP, 又能重新位于内质网[7-8]。表明, 除PEX3和PEX22外, 大多数PMP需要PEX19的介导才能定位于内质网。PEX3和PEX22如何定位于内质网, 目前尚不清楚。但有研究发现, PEX3可与PEX16结合, 并通过PEX16锚定于内质网上[9]; PEX3的氨基末端存在一段保守的信号锚序列, 可能在其定位中发挥作用[10]。

PEX19在介导PMP定位于内质网时, 首先, PEX19识别并结合于PMP的mPTS序列, 形成PEX19-mPTS-PMP复合体, 然后, 此复合体转运到膜的外侧, 与膜上的PEX3结合, 此过程需要ATP提供能量。结合后, 复合体中的PMP部分随即插入到膜上, 而作为转运蛋白的PEX19则从复合体上脱离, 重新回到胞质, 继续下一次的转运[8,11]。利用PMP24与绿色荧光蛋白(green fluorescent protein, GFP)的融合蛋白作为报告蛋白, 研究PEX19对PMP24的转运机制发现, PEX19与PMP24的结合不仅可以增加PMP24的稳定性, 而且与未结合PMP24的PEX19相比, 对PEX3表现出更高的亲和性[12], 表明PEX19在介导PMP的定位时, 既发挥胞质受体的功能, 又体现分子伴侣的作用。

2.2 未成熟前体的形成

未成熟前体的形成是指过氧化物酶体前体以囊泡形式从内质网脱落的过程。研究发现,pex3缺失的酵母细胞缺少过氧化物酶体[13]; 而用PEX3-YFP融合蛋白的表达质粒转染pex3缺失的酵母细胞[14], 重新引入PEX3后发现, 转染30 min, 黄色荧光出现在内质网; 60 min, 荧光汇聚到内质网膜的特定区域; 120 min, 荧光呈现出一个圆形结构, 从内质网脱落到胞质中。提示, PEX3不仅参与PMP在内质网膜上的整合, 还参与过氧化物酶体前体的形成过程。但最近Knoops等发现,pex3缺失的酵母细胞中存在过氧化物酶体前体的囊泡状结构, 但成熟的过氧化物酶体数量减少[13], 提示, PEX3的作用可能是参与过氧化物酶体前体的成熟, 而非前体本身的形成过程。因此, PEX3是否参与过氧化物酶体前体的形成还需进一步确认。

未成熟前体的形成需要PEX19和PEX16的参与。用荧光标记的PEX19转染pex19缺失的酵母细胞后发现, 一定时间后, 荧光出现在从内质网脱落的过氧化物酶体上[8]。同样, 用绿色荧光-PEX16的融合蛋白和过氧化物酶体标志基因的表达质粒共转染多种pex3或pex16缺失的哺乳动物细胞后发现, 绿色荧光出现在原本消失的过氧化物酶体内[15]。这些实验均表明, PEX19和PEX16在未成熟前体的形成中发挥作用。

最新的研究发现, 从内质网脱落的囊泡状前体结构相互之间并非完全相同, 而是包含不同的PMP。Van der Zand[16]等利用双分子荧光互补实验观察不同PMP的定位及其相互作用后发现, 不同的PMP出现在不同的小囊泡前体上, 随后, 这些囊泡发生互补融合, 形成具有完整基质蛋白转运系统的较大的前体, 以便于接下来基质蛋白向膜内的转运过程, 表明过氧化物酶体的前体具有异质性。但这些囊泡如何识别互补囊泡, 如何实现相互融合, 目前尚不清楚。

2.3 基质蛋白向膜内的转运

基质蛋白由核基因编码, 在胞质游离核糖体合成。与PMP一样, 基质蛋白的肽链上也含有定位序列, 这些序列能够指引基质蛋白透过过氧化物酶体的膜而进入其基质内, 因此, 称为过氧化物酶体定位信号(peroxisomal targeting signal, PTS), 目前发现的有PTS1和PTS2两种。多数基质蛋白的C末端含有PTS1, 只有少数蛋白含有PTS2, 位于N末端。PTS1是由S/A/C-K/R/H-L/H 3个氨基酸组成的三肽序列, 而PTS2的氨基酸组成更加多样, 为R/K-L/V/I-X5-H/Q-L/A的寡肽序列[17]。

新合成的基质蛋白转运进入过氧化物酶体的过程, 主要包括3个步骤: 首先, 基质蛋白通过PTS与胞质中的特异受体结合形成复合体, 这些复合体可运输基质蛋白到达过氧化物酶体膜的外侧。受体有两种, PEX5和PEX7。具有PTS1的基质蛋白与PEX5的亲和力高, 与PEX5结合形成基质蛋白-PTS1-PEX5复合体。而具有PTS2的基质蛋白与PEX7的亲和力高, 可与PEX7发生结合, 不仅如此, 对PEX7与基质蛋白形成的复合体进行结构分析后发现, PEX7在结合基质蛋白的同时, 还与PEX21等其他蛋白相结合, 提示PEX7可能需要与其他蛋白结合形成一个更大的复合体才能发挥转运活性, 转运机制更加复杂[18]。而携带了基质蛋白的PEX5, 随后与膜上的对接复合体结合而进入过氧化物酶体。对接复合体的构成根据物种不同而有所差异, 哺乳动物的对接复合体包括PEX13和PEX14两种蛋白, 而酵母细胞的对接复合体则由PEX13、PEX14和PEX17 3种蛋白组成[19]。进入基质后, PEX5或PEX7与携带的基质蛋白解聚, 将其释放入基质中。最后, 空载的PEX5或PEX7再在膜上对接复合体下游的转位复合体的作用下, 转出过氧化物酶体, 进入胞质, 继续下一次的转运[20]。转位复合体由3个含有环指结构域的蛋白质组成, 包括PEX12、PEX10和PEX2[21]。由于PEX5和PEX7能在胞质和过氧化物酶体的基质间来回穿梭, 因此, 基质蛋白向膜内的转运模式也称为穿梭受体模式。

3 过氧化物酶体的分裂增殖

目前公认的过氧化物酶体的分裂增殖包括延长、缩窄和分裂3个阶段。首先, 过氧化物酶体膜的特定部位发生极化, 向胞质侧伸出小的突起。突起不断延长(延长阶段), 达到一定长度后, 基质蛋白被转运到突起中, 使突起发生膨胀, 但同时, 突起的某些部位向中间缩窄(缩窄阶段),使整个突起形成类似串珠的结构。最后, 这些串珠结构在缩窄的部位发生断裂(分裂阶段), 产生新的过氧化物酶体[22]。

过氧化物酶体分裂增殖的各个阶段都需要特定蛋白质的参与, PEX11就是其中重要的一种。研究发现,pex11敲除的酵母细胞中出现巨型过氧化物酶体, 表明PEX11的缺失可导致过氧化物酶体无法分裂; 而过表达PEX11后, 巨型过氧化物酶体消失, 正常大小的过氧化物酶体数量增加[23]。这些实验确定了PEX11在过氧化物酶体分裂中的作用。进一步的研究发现, PEX11主要在过氧化物酶体的延长阶段发挥作用。用中性的小单层脂质体模拟过氧化物酶体的膜结构, 与包含PEX11 N末端的短肽共孵育, 发现PEX11可与脂质体发生结合[24], 这种结合使膜局部的脂质成分发生改变, 导致膜结构的不对称, 从而使膜发生弯曲, 表现为局部的突起; PEX11的N末端发生突变, 则其与膜的结合能力消失[24]。表明, PEX11参与膜的延长阶段。除此之外, PEX11还可募集线粒体分裂因子(mitochondrial fission factor, MFF)和动力样蛋白1(dynamin-like protein 1, DLP1)到过氧化物酶体的缩窄区[25]。DLP1具有GTP酶活性,可水解GTP, 为过氧化物酶体的分裂提供能量。

4 过氧化物酶体生物发生缺陷病

参与过氧化物酶体生物发生的pex突变, 使上述过氧化物酶体的生物发生过程不能正常进行, 导致成熟的过氧化物酶体缺失而引发的疾病, 称为过氧化物酶体生物发生缺陷病, 即PBD。

PBD可由不同的pex基因突变引起, 且不同的突变, 临床表现也不相同。以Zellweger syndrome (ZS)为例, 研究发现, ZS主要由PEX3、PEX16和PEX19的基因突变引起。此3种蛋白参与PMP在内质网膜上的整合以及过氧化物酶体前体的形成, 这些蛋白基因突变的直接后果是细胞内完全缺失过氧化物酶体。过氧化物酶体缺失, 则经其分解的代谢底物, 如VLCFA, 在细胞内累积, 而经其合成的代谢底物, 如缩醛磷脂和二十二碳六烯酸(docosahexaenoic acid, DHA), 则含量降低, 这种变化会对细胞造成损伤, 最终使患儿表现出严重的临床表现, 如严重的脑发育畸形和肝、肾等其他器官的功能异常, 患儿常在出生几个月内死亡[26]。而与基质蛋白转运相关的pex突变后, 由于基质蛋白不能被转运入过氧化物酶体, 病理结果显示细胞内有血影样的过氧化物酶体结构, 即过氧化物酶体呈现空泡状, 尽管也可能导致ZS, 但临床表现、病理和生化异常均较轻, 因此, 此类病人常能存活较长时间[27]。

5 结语

过氧化物酶体的生物发生主要依靠多种PEX来实现,pex突变或PEX蛋白功能缺陷会严重影响过氧化物酶体的生长增殖, 以至不能正常行使其功能, 导致疾病的发生。因此, 研究过氧化物酶体的生物发生对多种疾病, 尤其是PBD的诊断和治疗具有重要意义。虽然目前为止, 过氧化物酶体的生物发生过程已初具雏形, 但还有很多问题没有解决, 比如, 从头合成和分裂增殖有无物种特异性; 每条途径在同一物种发生所需的条件及其调节机制等, 相信随着分子细胞生物学和相应实验技术的发展, 有关过氧化物酶体的众多疑问将在不久的将来得到解释。

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Research progress in peroxisome biogenesis

SUN Yan, SUN Xue-pei, JIANG Ling-ling, SHI Yun

(Department of Biochemistry and Molecular Biology, Hebei Medical University, Shijiazhuang 050017, China)

Peroxisome is a subcellular organelle in eukaryotic cells. Its main function is involved in the processes of lipid metabolism, such as fatty acids and the regulation of oxidative stress balance. Recent studies have found that some diseases are associated with peroxisome biogenesis abnormalities. Peroxisome biogenesis refers to the formation of peroxisomes, includingdenovosynthesis and fission. In these two pathways, peroxisome biogenesis proteins, namely peroxin (Pex), are mutated leading to peroxisome formation deficiency and finally cause diseases. Therefore, it helps to provide a basis for the diagnosis and therapy related diseases to review the research progress of peroxisome biogenesis.

peroxisome; peroxin; peroxisomal biogenesis disorders

2014-08-15；

2014-09-29

河北省自然科学基金(C2011206051); 河北省科技支撑计划项目(132777181)

孙艳,硕士研究生, 主要从事过氧化物酶体的脂质代谢与老年病的关系研究,E-mail: sunyan198702@163.com;

石芸, 博士, 讲师, 主要从事脂质代谢与老年病的关系研究, E-mail: shycaoer@163.com。

Q26; R362

A

2095-1736(2015)02-0083-04

doi∶10.3969/j.issn.2095-1736.2015.02.083