海洋微生物产纤维素酶及其应用研究进展

韩 笑, 闫培生, 史翠娟, 杨树燕, 李永鹏, 邹雪平

哈尔滨工业大学(威海)海洋科学与技术学院,山东 威海 264209



海洋微生物产纤维素酶及其应用研究进展

韩 笑, 闫培生*, 史翠娟, 杨树燕, 李永鹏, 邹雪平

哈尔滨工业大学(威海)海洋科学与技术学院,山东 威海 264209

纤维素是地球上最古老、最丰富的天然高分子，是天然可再生资源。纤维素酶广泛存在于自然界的生物体中，细菌、真菌和动物体内都能产生纤维素酶。微生物产纤维素酶已有较多报道，并在食品、医药、饲料、洗涤、纺织和造纸工业等领域有广阔的应用前景。海洋是一个巨大的资源库，海洋微生物产纤维素酶已经受到了广泛的关注。对产纤维素酶海洋微生物的种群、来源及基因筛选、海洋微生物产纤维素酶的酶学特性，以及纤维素酶的应用领域等方面的研究进展进行了简要综述，并对海洋微生物产纤维素酶的研究进行了展望。

海洋微生物；纤维素酶；纤维素

纤维素是世界上最丰富的可再生天然有机资源，每年通过全球陆地生物合成可再生纤维素的总量约为560～1 200亿t[1]，占植物界碳含量的50%以上。纤维素是一种复杂的多糖，由8 000～10 000个葡萄糖残基通过β-1，4糖苷键连接而成。纤维素酶是降解纤维素生成葡萄糖的一组酶的总称，它不是单体酶，而是起协同作用的多组分酶系，是一种复合酶，主要由外切β-葡聚糖酶、内切β-葡聚糖酶和β-葡萄糖苷酶等组成，还包括活力很高的木聚糖酶。只有各组分酶共同作用时才能将纤维素彻底水解为葡萄糖[2]。1906年，Seilliere首次在蜗牛消化液中发现了纤维素酶[3]，自此纤维素酶受到了广泛关注。将天然纤维素降解为可利用的糖液，再进一步转化为酒精、菌体蛋白、气体燃料如氢气等物质，对解决当今世界所面临的粮食短缺、能源危机和环境污染问题具有深远的意义[4]。从经济效益角度分析，在当前的酶制剂领域中，纤维素酶是全球第三大工业酶制剂[5]。但纤维素酶的使用成本占酶糖化纤维材料总成本的25%～50%[6]，限制了纤维素酶在各个领域的应用。因此，选育出高产、高酶活的菌株是亟待解决的问题。

海洋微生物资源丰富、生境独特，从中能够获得丰富的纤维素酶种类，特别是极端酶。对极端酶加以改造，构建高效工程菌株实现纤维素酶的高效表达，并能满足工农业生产的特殊条件要求，从而降低酶制剂的成本。因此，深入挖掘海洋微生物纤维素酶基因在提升纤维素酶效率方面潜力巨大，应用前景广阔，并且来源于海洋微生物的纤维素酶在实际应用中的比例较低，尚有很大的可开发空间。

1 海洋微生物与产酶特性

海洋总面积约为3.6亿km2，约占地球表面积的71%，海水下有多种地质结构，例如海洋沉积物、洋壳、热液口和冷泉等。这些多样的地质结构孕育了丰富多彩的生命，构成了最大的微生物生态系统[7]。

1.1 海洋微生物特性

与陆地相比，海洋环境以高盐、高压、低温和稀营养为特征，海洋微生物想要生存就需要长期适应独特的海洋地质结构及海洋环境，这使得海洋微生物的生理结构、代谢方式和生物行为都与陆生微生物有很大差异。

由于海水中钠含量较高，海洋微生物最普遍的特点便是耐盐性或嗜盐性。海洋微生物还具有耐冷性或嗜冷性，大约90%的海洋环境温度都在5℃以下，大多数海洋微生物的生长要求较低的温度。当然也存在着部分嗜热性海洋微生物，这些海洋微生物生活在深海热液口或火山口附近，洋壳中的流体在热液口附近可被加热到100～300℃(有的甚至达到400℃以上)后喷出[7]，使得此处的微生物具有嗜热性。海洋微生物还具有嗜压性，海水中静压力随水深增加而增大，水深每增加10 m，静水压力递增1个标准大气压，浅海微生物能忍耐较低压力，深海微生物则能在高压环境下生长并保持其酶系统的稳定性。除上述特性外，海洋微生物还有低营养、趋化性、附着生长、多形性和发光性等特点。

1.2 海洋微生物酶的特性

研究表明海洋微生物可以产生纤维素酶、蛋白酶、多糖酶、溶菌酶、脂肪酶、木聚糖酶、氢化酶、谷氨酰胺酶和DNA聚合酶等[8]。海洋微生物需要适应海洋中各种各样的极端环境，也因此产生了一些有别于陆生微生物的具有特殊生理活性的酶。

在极端海洋环境中生长的微生物会产生特殊耐受性的极端酶，例如：耐冷菌和嗜冷菌会产生低温酶，此类酶在低温条件下仍具有较高活性，在应用时不易受杂菌污染；嗜热菌会产生在高温100℃下仍可稳定存在的酶；嗜压菌可产生嗜压酶，可解决在高压下酶的化学键易被破坏、酶的构象改变而失活的问题；嗜盐菌可产生嗜盐酶，此酶对盐有极高的耐受性，可应用在海产养殖等领域；利用海洋微生物还可产生耐酸或耐碱的极端酶[8]，在洗涤剂、食品等产业有广阔的应用前景。

2 产纤维素酶的海洋微生物

已报道的产纤维素酶的微生物大多数为陆生微生物，极少有海洋微生物，深海微生物更加稀少。对海洋微生物纤维素酶的最早研究报道是来自海岸湿地红树林生态系统的微生物[9]，后续的研究涉及的海域逐步扩展，从极地到热带，从海水表面到海底都已经有研究成果报道[10]。

2.1 胞外纤维素酶产生菌

在工业生产过程中，更希望得到的是拥有较高酶活的胞外酶，韩韫等[11]在广东省汕尾鲍鱼场采集的样品中，分离筛选出两株菌，初步鉴定为溶藻弧菌(Vibrioalginolyticus)和温和产气单胞菌(Aeromonassobria)，均可分泌胞外纤维素酶，其分解纤维素的酶活分别为10.3 U/mL和11.5 U/mL，降解能力很强。刘杰凤等[12]从东海海底泥中分离得到一株海洋黑曲霉(AspergillusnigerZJUBE-1)，该菌株能在以纤维素为基质的培养基中诱导产生胞外纤维素酶酶系。

2.2 低温纤维素酶产生菌

深海以及海冰、冰川海泥等提供了丰富的嗜冷菌资源，能够筛选到有价值的低温酶产生菌，近年来，许多学者开展了嗜冷纤维素酶的筛选研究。王玢等[13]从黄海的深海海底泥中筛选出一株产纤维素酶的海洋细菌，研究表明该菌种最适生长温度为20℃，在0℃下也能生长，为嗜冷菌，该菌能产生羧甲基纤维素酶，也能降解微晶纤维素，并且有淀粉酶活性，该纤维素酶最适反应温度为35℃，在10℃时仍有较高酶活，最适pH为6.0。刘军等[14]从北极冰川海面下1 500～4 000 m处的海泥样品中筛选出8株嗜冷细菌，其中菌株P371可产生纤维素酶。钱文佳等[15]从南极海冰细菌中筛选到产纤维素酶的交替假单胞菌Pseudoalteromonassp.545，该菌在0～10℃范围内均有较高产酶能力，所产纤维素酶最适作用温度为35℃，在0～60℃范围内均有活性，pH 9.0时酶活最高，pH 6.0～10.0内均有较高活性，由此可见该菌所产纤维素酶属低温碱性酶。

2.3 碱性纤维素酶产生菌

在海洋微生物纤维素酶的研究中还有很多学者关注于碱性纤维素酶。钱文佳等[15]筛选出的交替假单胞菌所产纤维素酶便是碱性酶。徐庆强等[16]从青岛近海海域海水中分离筛选出一株耐冷菌，经16S rDNA鉴定，该菌株为噬纤维素菌Cytophagafucicola，所产纤维素酶在pH 9.0时具有最高酶活，在碱性条件下有较高酶活和较好稳定性，同样属碱性纤维素酶。曲均革等[17,18]从宁波洋沙山和梅山岛海域采集的样品中通过2种途径筛选出产纤维素酶的细菌菌株，经复筛得到一株高产碱性纤维素酶的海洋细菌，16S rDNA鉴定为交替假单胞菌属，其产纤维素酶反应的最适pH为9.0，pH 7.0～10.0范围内均有较高酶活。

2.4 耐热纤维素酶产生菌

部分海洋微生物能够产生具有热稳定性的纤维素酶。Dipasquale等[19]从深海热液口分离筛选出一株栖热腔菌Thermosiphosp.strain 3，该菌厌氧嗜热并且发酵产氢，经16S rDNA分析，此菌与非洲栖热肠菌(Thermosiphoafricanus)序列相似性达99.5%，可产生一种具有热稳定性的内切纤维素酶，可水解羧甲基纤维素和β-葡聚糖，在pH 5.5、80℃时酶活最高，是典型的高温条件下稳定的纤维素酶。国内对产耐热纤维素酶的海洋微生物的报道较少，罗颖等[20]从东海温泉的热源地区采集的样品中筛选出一株可在60℃下生长的菌种，经鉴定将该菌命名为热葡糖苷酶地芽胞杆菌(Geobacillusthermoglucosidasius)，该菌株兼性好氧，所产生耐热性纤维素酶在45～60℃间表现较高酶活。

2.5 耐盐纤维素酶产生菌

在很多方面比如造纸、治理海洋垃圾等需要耐盐性的纤维素酶，薛栋升[21]从海洋中筛选出一株嗜盐海洋黑曲霉(Aspergillusniger)，经研究表明该菌所产的纤维素酶在12% NaCl溶液中酶活最大，是在无NaCl溶液中酶活的1.33倍，即使在24% NaCl下仍具有产酶能力[12]，是良好的耐盐纤维素酶。产竹华等[22]从天津滨海、山东东营、江苏连云港、福建厦门和海南三亚等地近海海域采集的样品中分离筛选出的4株中度嗜盐菌株均能够产纤维素酶，通过摇瓶实验，测定纤维素酶在高盐条件下均具有较强酶活。目前，我国对耐盐纤维素酶的研究有限，大多是对盐碱地土壤样品中的菌种进行研究，对海洋来源的耐盐纤维素酶产生菌的筛选少之又少，有着极大的发展空间。

3 海洋来源的纤维素酶基因工程

尽管纤维素酶系中的某些基因已克隆并在受体菌中得到表达，但仍需要进一步开发具有高产酶活性的高效菌株，以及构建同时具备多种特性以适应工业生产条件的工程菌株。从海洋环境筛选到的纤维素酶种类丰富，同时兼具多种特性较易实现在工业中的应用(如低温碱性酶等)，因此海洋微生物纤维素酶为构建高酶活性、高产酶量的工程菌株奠定了基础。游银伟等[23]从黄海深海海底泥中分离筛选出一株交替假单胞菌Pseudoalteromonassp.MB-1，并对其适冷内切葡聚糖酶基因celA进行克隆，获得重组质粒pGEX-celA，在大肠杆菌中进行表达后得到融合蛋白GST-CelA，经分析测定，此融合蛋白最适反应温度为35℃，最适pH为7.2，是一种中性适冷酶。李相前等[24]对海栖热袍菌(Thermotogamaritima)极耐热胞外酶Cel12B和木聚糖酶XynA CBD结构域基因融合，构建了重组质粒pET-20b-Cel12B-CBD，经诱导表达后，对结晶纤维素有水解活性，酶反应最适温度为100℃，最适pH为5.8，属极耐热酶。董俊丽[25]筛选分离出有纤维素酶活性的深海细菌Martelellamediterranea，序列对比显示该菌株与M.mediterraneastrain 2PR511-4同源性达100%。将其纤维素酶基因cel5D基因克隆到表达载体pGEX-6P-1上，使重组质粒在大肠杆菌中诱导表达，该基因所产酶经纯化后在60℃和pH 5.0时活性最高，在60℃以下，pH 3.0～11.0时酶活性较稳定。

4 海洋纤维素酶的应用前景

纤维素酶是生物体产生的活性物质，可以安全、高效、无污染地降解纤维素，这是其他方法无法比拟的，特别是在能源短缺、污染严重的现实情况下，纤维素酶的深入开发利用已经引起了全世界的关注[26]。随着研究的不断深入，纤维素酶的应用也逐步拓展，在食品、饲料、造纸、纺织、中草药的提取、能源和洗涤等领域均发挥着举足轻重的作用。海洋纤维素酶的极端耐受性等特性使其可以很好的应用于上述工业领域。

4.1 洗涤剂工业中的应用

碱性纤维素酶在洗涤剂工业中具有良好的应用前景。碱性纤维素酶一般不能作用于结晶纤维素，不受去污剂及其他添加剂影响。90%的污染物附着在棉纤维之间，碱性纤维素酶作用于非结晶区，能有效地软化、水解纤维素分子与水、污垢结合形成的凝胶状结构[27]，使污垢洗脱出来，且棉麻织物的强度和表观聚合度不会发生显著改变[28]。碱性纤维素酶能很好地适应洗涤剂的碱性条件。

4.2 食品工业中的应用

4.2.1 酱油酿造 酱油是一种富有营养的调味品，按发酵工艺可分为两类，高盐稀态发酵酱油和低盐固态发酵酱油，在酱油发酵过程中食盐是必不可少的原料之一，盐度会直接影响酿造过程中使用的酶制剂的活性[29]。酱油的天然酿造过程中需要加入淀粉酶、蛋白酶等多种酶[30]，在酶解过程中适当地加入耐盐纤维素酶，可以使大豆等原料的细胞膜软化、膨胀，使细胞中的蛋白质、碳水化合物等物质释放，缩短酿造时间，提高产率和产品品质[31]。

4.2.2 果蔬加工 在果蔬加工过程中，常采用加热蒸煮和酸碱处理等方法使植物组织快速软化和膨润，这样会破坏果蔬的香味并损失营养物质[31]。在果蔬加工过程中用纤维素酶进行适当处理，可以使植物组织软化，改善口感，简化工艺。近年来，冷冻干燥技术已成功应用于制备脱水蔬菜的过程中，在制备脱水蔬菜过程中用低温纤维素酶进行适当处理后再干燥脱水，可改进脱水蔬菜的复原性并且能够避免蔬菜中维生素等营养物质的过度流失。

纤维素酶还可应用于啤酒糖化、白酒酿造、大豆加工和饮用品加工等过程中[31]。

4.3 生物能源中的应用

21世纪是能源竞争最为激烈的世纪，世界各国都在争取现有能源的同时大力开发新能源。美国早在20世纪就已经认识到乙醇燃料的优势，强制在燃料中添加10%的乙醇[32]。刘羽[33]从南极菌株产物中分离纯化得到低温纤维素酶，同步糖化发酵实验结果表明该低温纤维素酶可降解纤维素产生乙醇，其低温特性能有效解决同步糖化发酵过程中酵母生长温度与纤维素酶最适酶活温度不一致的问题。高丛[34]筛选出产纤维素酶南极菌株后获得低温纤维素酶，该低温纤维素酶可将海带纤维素降解成可被酵母菌发酵利用的单糖并用于乙醇的发酵生产，为制备纤维素乙醇开发了新型、充足且廉价的原料。纤维素酶除可以用来制备燃料乙醇，还可发酵制沼气。李亚冰[35]用从兼性厌氧菌株中得到的纤维素酶以秸秆为原料成功进行了沼气发酵。

5 展望

纤维素是地球上最大的可再生资源库，天然存在的纤维素大多被微生物所降解，没有得到充分利用，这是极大的资源浪费，如何能充分利用这个巨大的资源库是值得关注的重点。纤维素有多种分解方法，但最有效的方法莫过于生物降解。至今，已有大量纤维素酶的研究成果，但这远远不足以满足需求。产纤维素酶菌种的筛选虽已取得一定进展，但尚不能很好地满足工业生产要求，因此，获得高酶活的高产纤维素酶菌种仍是今后需重点解决的问题。目前多数报道是从陆生微生物中筛选出产纤维素酶的菌种，大多不能在工业生产的特殊条件下保持高酶活性和稳定性。随着研究人员更多的将目光投向海洋，未来将会有海洋微生物纤维素酶真正实现工业化应用。然而要实现这一愿景，还需要在海洋微生物极端环境耐受性机理上开展深入研究，从微生物代谢途径方向对产酶机制进行研究，以及在利用高通量的定向进化等技术获得性能更稳定、更优良的纤维素酶产生菌方面开展研究。

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Research Progress on Cellulase Producing by Marine Microorganisms and its Application

HAN Xiao,YAN Pei-sheng*,SHI Cui-juan,YANG Shu-yan,LI Yong-peng,ZOU Xue-ping

SchoolofMarineScienceandTechnology,HarbinInstituteofTechnologyatWeihai,ShandongWeihai264209,China

Cellulose is the most ancient，abundant and inexhaustible natural polymer resources.Cellulase widely exists in the organism including bacteria，fungi and animals.Microbial cellulase has been widely reported and utilized in industries of food， medicine， feed， detergent， textile， pulp and paper，etc..The ocean is a huge pool of resources，and cellulose-producing marine microorganisms have attracted a lot of attention.This paper briefly summarized the research progress of populations and source of marine microorganisms producing cellulase and genetic screening，the enzymatic properties and application fields of cellulase produced by marine microorganisms.Prospects of study on marine microbial cellulase were also discussed.

marine microorganisms; cellulase; cellulose

2015-04-22; 接受日期：2015-05-07

中国大洋协会国际海域资源调查与开发“十二五”重大项目(DY125-15-R-01)；哈尔滨工业大学优秀团队支持计划资助。

韩笑，本科生，主要从事食品科学与工程研究。E-mail：1243966565@qq.com。*通信作者：闫培生，教授，博士生导师，研究方向为海洋微生物资源与利用、海洋生物质及其加工废物的高值资源化、有害微生物的生物防治与生物农药、微生物发酵工程与生物制药等。E-mail: yps6@163.com

10.3969/j.issn.2095-2341.2015.03.07