多色荧光原位杂交检测尿沉渣诊断膀胱尿路上皮癌的可行性分析

杨涛　李燕　李岩　刘俊江　孙福振　王刚

作者单位: 050051石家庄市，河北省人民医院泌尿外科(杨涛、刘俊江、孙福振、王刚)，血液内科(李燕)，体检中心(李岩)

多色荧光原位杂交检测尿沉渣诊断膀胱尿路上皮癌的可行性分析

杨涛李燕李岩刘俊江孙福振王刚

作者单位: 050051石家庄市，河北省人民医院泌尿外科(杨涛、刘俊江、孙福振、王刚)，血液内科(李燕)，体检中心(李岩)

【摘要】目的研究分析多色荧光原位杂交检测尿沉渣诊断膀胱尿路上皮癌的可行性。方法选取膀胱尿路上皮癌患者30例，纳入对照组。选取30例正常人，纳入观察组。2组均进行荧光原位杂交(fluorescence in situ hybridiza-tion，FISH)检测尿沉渣，统计并分析染色体畸变情况。结果观察组与对照组3、7、17、9p21染色体畸变数差异有统计学意义(P<0.05)。3探针敏感性为36.67%，7探针敏感性为43.33%，17探针敏感性为40%，9p16探针敏感性为50%，4组合用探针敏感性为70%显著高于单独使用，差异有统计学意义(P<0.05)。结论多色荧光原位杂交检测尿沉渣诊断膀胱尿路上皮癌诊断疗效显著，值得临床广泛推广及应用。

【关键词】多色荧光原位杂交检测;膀胱尿路上皮癌;诊断

E-mail: tommy325523@163.com

荧光原位杂交(fluorescence in situ hybridization，FISH)在医学临床上广泛应用，其中以乳腺癌HER-2基因检测最为广泛指导其临床治疗。目前在实际的使用荧光原位杂交技术的过程中，也开始使用一种全新的方式，即使用本文中提到的多色荧光原位杂交技术，这种技术能够更好的显示出在实际的检测过程中的多种颜色，并能够减轻在实际的对恶性肿瘤在检测的过程中出现的诸如显示不清以及观察无法达到相关要求的情况，对于患者而言有着极为重要的意义。本研究将FISH运用于膀胱尿路上皮癌检测尿沉渣来进行诊断，体现3、7、17、9p21染色体畸变在诊断检测膀胱尿路上皮癌的临床价值。报告如下。

1　资料与方法

1.1一般资料选取我院2011年8月至2013年8月收治的膀胱尿路上皮癌患者30例为对照组。男18例，女12例;年龄37～68岁，平均年龄(52±6)岁;所有患者均确诊为膀胱尿路上皮癌。观察组30例，男16例，女14例;年龄39～70岁，平均年龄(54±6)岁。2组患者年龄、性别比等一般资料比较差异无统计学意义(P＞0.05)具可比性。

1.2方法

1.2.1对2组均采取膀胱尿路上皮癌进行检测。取2组患者晨尿200 ml检测。

1.2.2多色荧光原位杂交检测。首先注意对特异性探针进行相应的处理。探针由北京金菩嘉公司赞助的膀胱癌诊断试剂盒，在这种试剂盒中，主要是含有CSP3/CSP7以及GLP17/GSP17两组一套的双色探针设备，在这种探针使用的的过程中，探针往往能够定位3p11.1～q11.1以及7p11.1～q11.1，同时在对应的荧光信号方面，能够对应红色以及绿色的荧光信号。对于GPL p16/CSP 17的探针组，能够定位9p21以及17p11.1～q11.1，同时对于于GPL p16/CSP 17的探针组，在对应的荧光信号方面能够对应红色以及绿色的信号。在对特异性的探针在选择完成以及进行相关的处理完成后，需要注意对于主要的相关使用溶液进行配置。本研究中的缓冲液的配置，使用88 g氯化钠44 g柠檬酸钠以及400 ml的去离子水进行配置，在实际的配置过程中，将所有的物质进行充分的溶解，要在常温下进行pH值的调节，使用盐酸将pH值调整在5.3左右，同时使用离子水进行定容，容量为500 ml同时注意在2～8℃的环境下进行储存，也需要注意保质期，一般在配置完成后6个月后需要丢弃，在此过程

情况，立即将试剂室温下将10 mol/L值调整在7.0左液进行定容，定容至的环境下进行相应需要注意对其进行了浑浊或是污染等溶液的配置方面，需要注意选择70%以及85%的乙醇，在实际的乙醇溶液的配置过程中，注意将700 ml以及850 ml的无水乙醇，通过使用去离子水对于无水乙醇进行稀释，分别将无水乙醇稀释到1l，同时需要注意在无水乙醇的使用过程中，将乙醇放置在2～8℃的环境下进行储存以及使用，在配置完成后的1个月后或使用20张的玻片进行杂交完成后立即丢弃，试剂在此过程中，出现实际的污染或浑浊的情况，立即丢弃。玻片处理:用RNase (Sigma，0.1 g/L)和Pepsin(Sigma，0.1 g/L)先后处理，10 g/L多聚甲醛固定15 min，PBS缓冲液洗涤后，玻片在700 ml/L甲酰胺/2×SSC(pH值7.0)，72℃变性3 min，2×SSC 4℃3 min洗涤2次，梯度乙醇脱水，室温晾干。探针处理:按照探针2 μl、ssDNA 2 μl (或Cot-1 DNA 2 μl)、H2O 46 μl、3 mol/L NaAc 5 μl、100%乙醇(－20℃) 110μl配成沉淀体系，置－80℃30 min，12 000 r/min离心10 min，去上清加75%乙醇洗涤，再离心去上清，避光自然晾干，加着丝粒(或BAC)探针杂交液8μl，室温避光溶解30min以上，75℃水浴变性7 min，37℃水浴预复性30min。杂交:将探针加到玻片的标本上，覆盖玻片，Rubber Cement封片后置湿盒37℃温箱中避光杂交48 h。洗片:除去盖玻片，将玻片放入500ml/L甲酰胺/2×SSC溶液，42℃洗涤15 min，2×SSC室温摇洗3 min×2次，梯度乙醇脱水，室温暗处晾干，加20 μl二氨基苯基吲哚(DAPI，Vysis公司)复染，封片。

1.3信号检测在荧光显微镜下观察图像，单体标准:单个信号的核比例＞15%。三体及以上标准:三个及以上信号的核＞10%细胞总数。组合探针标准:至少4个细胞中有两个染色体扩增同时存在3、7、17中或至少在12个细胞中存在9p21纯合性缺失。

1.4统计学分析应用SPSS 19.0统计软件，计量资料以±s表示，采用t检验，计数资料采用χ2比较，P＜0.05为差异有统计学意义。

2　结果

2.12组患者3、7、17、9p21四种探针诊断结果比较观察组与对照组比较，差异有统计学意义(P＜ 0.05)。见表1，图1、2。

表1　2组患者3、7、17、9p21四种探针检测结果比较n=30，±s

表1　2组患者3、7、17、9p21四种探针检测结果比较n=30，±s

组别37917观察组8.56±1.86　8.13±1.47　4.19±1.89　7.11±1.98对照组　14.33±4.96　11.23±4.22　10.36±4.61　11.56±5.33 t值5.9660　3.7996　6.7577　4.2867 P值0.0000　0.0003　0.0000　0.0001

图2　17号染色体(绿色荧光)显示异常增多核型

图1　17号染色体(绿色荧光)异常增多核型; 9p21(红色荧光)为单倍体，异常缺失

2.23、7、17、9p21四种探针诊断膀胱尿路上皮癌情况4种组合使用疗效较单独使用差异有统计学意义(P<0.05)。见表2。

表2　3、7、17、9p21及四种联合诊断膀胱尿路上皮癌情况n=30，例(%)

3　讨论

膀胱尿路上皮癌在泌尿系统较为多见的肿瘤［1］，也是一种常见的泌尿系统恶性肿瘤。在我国的一项登记检查中发现，膀胱癌的发病几率已经达到了6.61/10万，约为恶性肿瘤发病的第9位。膀胱癌可发于任何年龄，甚至有儿童也会出现膀胱癌的相关症状，其发病率会随着年龄的增长而增加，高发年龄在50～70岁，同时男性膀胱癌的发病率约为女性膀胱癌发病率的4倍左右。在1998年，国际泌尿病理学会以及国际卫生组织(WHO)建议使用尿路上皮一词代替移行细胞一词，通过这种方式能够较好的对患者辩别鼻腔以及卵巢内部的移行上皮，并通过这种方式，能够使得尿路上皮成为了一种尿路系统的专有名词。在2004年，国际卫生组织又发布了《泌尿系统及男性生殖器官肿瘤病理学和遗传学》。通过这种形式，能够将患者尿路系统肿瘤组织学分类过程中的膀胱癌的病理类型，其中包括膀胱尿路上皮癌、膀胱腺癌、膀胱鳞状细胞癌，同时还有膀胱透明细胞癌以及膀胱小细胞癌和膀胱类癌等，其中最为常见的就是膀胱尿路上皮癌，目前约占所有膀胱癌患者总数的90%左右，通常所说的膀胱癌大部分就指的是膀胱尿路上皮癌，在以往被称为膀胱移行细胞癌。临床上采取膀胱镜检查及尿细胞学，膀胱镜检查属有创性检查对患者影响较大［2～3］。尿细胞虽属无创但灵敏度较差。目前多色荧光原位杂交检测在临床上得到认可，能填补上述检测缺陷，具备特异性强能直接在染色体上定量标记及定性、属无创检查、敏感度较高，操作简单、稳定、重复性好等优点［4］。据研究显示，多色荧光原位杂交检测诊断膀胱尿路上皮癌特异性为86%～97%，敏感度为59%～86%［5］。尿路上皮癌患者9p21均缺失，是早期诊断的重要标志，3号染色体畸变达76%，17号畸变达51%，7号畸变达38%［6］。本研究我院30例患者采取FISH诊断敏感性高达80%，与研究相符。采用FISH检测患者与正常人比较，差异有统计学意义(P<0.05)。在FISH检测中发现，4种探针组合使用70%显著高于3、7、9、17单独探针，差异有统计学意义(P<0.05)。

对于多色荧光原位杂交检测技术而言，是一种目前较为常用的物理图谱绘制的相关方法，在实际的绘制过程中，需要使用荧光素对探针进行相应的标记，并在标记完成后需要检测探针以及分裂中期染色体或是在分裂间期的染色体杂交的情况［7］。这种方法主要是上个世纪80年代在放射性原位杂交技术的基础上开发出的一种非放射性分子细胞的相关遗传技术，通过使用荧光标记的方式，能够较好的对同位素标记进行相应的代替，并在代替后能够成为一种全新的原位杂交方法。在实际的使用过程中，首先能够和某一种介导分子进行结合，在结合完成后能够通过杂交等形式再通过免疫细胞化学的相关过程中，和荧光染料进行连接。在此过程中，主要是需要使用DNA探针对于特殊的核苷酸分子进行相应的标记，在标记完成后可以使用探针直接的杂交到染色体或是DNA的纤维切片上，并需要使用荧光素分子偶联的单克隆抗体和探针分子的特异性结合，通过这种形式能够较好的检测出DNA相关的序列在DNA的纤维切片或是在染色体上的定位以及相对的定量分析［8］。在实际的使用荧光原位杂交的过沉重，在实际的检测过程中往往具有快速、安全、灵敏以及能够显示多种颜色等特点，不仅是在显示的过程中能够对于显示中期的分裂相进行相应的显示，同时也能够显示出间期核［9］。目前在实际的使用荧光原位杂交技术的过程中，也开始使用一种全新的方式，即使用本文中提到的多色荧光原位杂交技术，这种技术能够更好的显示出在实际的检测过程中的多种颜色，并能够减轻在实际的对恶性肿瘤在检测的过程中出现的诸如显示不清以及观察无法达到相关要求的情况，对于患者而言有着极为重要的意义［10］。尤其是对膀胱尿路上皮癌患者而言，在临床进行检测的过程中，往往会由于其特点无法使用CT MRI或X线平片技术对患者的病灶进行相应的观察因此对于膀胱尿路上皮癌患者在检测的过程中通过使用多色荧光原位杂交技术技术，能够及时有效的对膀胱尿路上皮癌患者进行检测，对于患者的技术有效治疗以及制定治疗方案而言有着极为重要的意义，同时在实际的对膀胱尿路上皮癌在检测过程中也会具有安全、快速、灵敏度高、探针能长期保存、能同时显示多种颜色等优点，在临床上也值得推广应用［11］。

本研究发现观察组与对照组3、7、17、9p21染色体畸变数差异有统计学意义(P<0.05)。3探针敏感性为36.67%，7探针敏感性为43.33%，17探针敏感性为40%，9p16探针敏感性为50%，4组合用探针敏感性为70%显著高于单独使用，差异有统计学意义(P 0.05)，这种情况说明在临床对膀胱尿路上皮癌患者在进行检测的过程中，使用多色荧光原位杂交检测技术是切实有效的，能够在临床对膀胱尿路上皮癌患者进行及时有效的诊断［12］。同时在此过程中，需要注意进行阈值的建立。在实际的阈值建立的过程中，需要对于正常人的尿液进行FISH的检验，同时也需要注意每一个探针组合需要对于100各信号较为清晰的细胞，同时在此过程中，需要注意对于2号、7号以及1号的染色体进行阈值的建立，在实际的建立过程中，需要注意建立起3个或3个以上的阈值。而对于PL6而言，需要建立起2个阈值，并需要爱此过程中将异常信号细胞数字的百分比进行相应的统计，使用相关的阈值计算公式对于阈值进行相应的计算。同时对于形态异常的脱落细胞进行分析的过程中，需要注意，每一组的探针组合应该对至少25个细胞进行相应的分析，若在此过程中无法较好的对于结果进行相应的确定，可以在实际的对于异常脱落细胞进行分析的过程中，可以对于分析细胞的数量进行增加，同时在此过程中，细胞的增加数量并没有上限。在对FISH进行测定的过程中，需要注意两个指标阳性就能够确定FISH为阳性。同时对于一个指标出现了复杂异常的情况，若出现了一个指标出现了复杂异常的情况则表示每一种的异常信号模式细胞的数量高于4。

综上所述，多色荧光原位杂交检测尿沉渣诊断膀胱尿路上皮癌诊断疗效显著，具备特异性强能直接在染色体上定量标记及定性、属无创检查、敏感度较高操作简单、稳定、重复性好值得临床广泛推广及应用。

参考文献

1丁雪飞，李汉忠，严维刚，等.多色荧光原位杂交检测尿沉渣诊断膀胱尿路上皮癌.基础医学与临床，2010，30: 293-296.

2李莉，丁奕星，徐苓，等.染色体3、7、17号和9p21位点在膀胱尿路上皮癌中的畸变情况及其临床意义.诊断学理论与实践，2012，11: 47-51.

3陈敏丰.荧光原位杂交技术在尿路上皮癌及前列腺癌的临床研究.中南大学，2010.

4张业贵.M-FISH技术在膀胱尿路上皮癌诊断中的应用研究.安徽医科大学，2007.

5王一，孙光，刘晓强，等.荧光原位杂交在尿路上皮癌诊断中的应用.中国肿瘤临床，2011，38: 148-150，154.

6吴晓斌，赖仁胜，贺亚敏，等.尿路肿瘤细胞多重荧光PCR微卫星不稳定和荧光原位杂交的联合诊断.海南医学，2011，22: 133-136.

7邱晓拂，胡卫列.荧光原位杂交应用于尿路上皮癌尿液早期诊断的研究进展.现代生物医学进展，2011，11: 2986-2988.

8许庆均，叶烈夫，何延瑜，等.荧光原位杂交技术在尿路上皮肿瘤诊断中的作用.中华临床医师杂志，2012，06: 4419-4421.

9原小斌.荧光原位杂交技术(FISH)在尿路上皮肿瘤诊断中的应用研究.山西医科大学，2009.

10张艳平.荧光原位杂交(FISH)在3、7号染色体诊断膀胱癌中的应用研究.河北医科大学，2009.

11李晓娟，符生苗，刘元晓，等.荧光原位杂交技术检测膀胱癌染色体畸变的研究.中国热带医学，2012，12: 70-72.

12郭洪波.荧光原位杂交检测尿路上皮癌分子细胞遗传学变异的临床应用研究.天津医科大学，2009.

(收稿日期:2014－12－20

通讯作者:刘俊江，050051河北省人民医院泌尿外科;

doi:10.3969/j.issn.1002－7386.2015.09.011

【文章编号】1002－7386(2015) 09－1319－04

【文献标识码】A

【中图分类号】R 694