食管鳞状细胞癌中DMBT1和CD44v6的表达及意义

罗文彦　成媛　胡蔼园　左连富　何丽英

作者单位: 050200石家庄市，河北中医学院基础医学院病理学教研室(罗文彦、成媛)，组织胚胎学教研室(胡蔼园)，人体解剖学教研室(何丽英) ;河北医科大学肿瘤研究所(左连富)

食管鳞状细胞癌中DMBT1和CD44v6的表达及意义

罗文彦成媛胡蔼园左连富何丽英

作者单位: 050200石家庄市，河北中医学院基础医学院病理学教研室(罗文彦、成媛)，组织胚胎学教研室(胡蔼园)，人体解剖学教研室(何丽英) ;河北医科大学肿瘤研究所(左连富)

【摘要】目的探讨食管鳞状细胞癌组织中抑癌基因DMBT1以及粘附分子CD44v6的表达及与肿瘤生物学行为的关系。方法应用免疫组织化学方法检测70例食管鳞状细胞癌组织及23例切缘正常组织中DMBT1、CD44v6的表达情况。结果DMBT1、CD44v6在癌组织中的表达减弱或呈阴性。DMBT1的表达与食管鳞状细胞癌组织的分化程度、淋巴结的转移有关(P<0.05)，与癌组织的浸润深度无关(P＞0.05)。CD44v6的表达与食管鳞状细胞癌组织的淋巴结的转移有关(P<0.05)，与癌组织的分化程度、浸润深度无关(P＞0.05)。结论DMBT1的表达减弱是食管鳞状细胞癌组织低分化和高度恶性的生物学标志，并与淋巴结的转移密切相关，CD44v6主要与食管鳞状细胞癌的发生与淋巴结的转移密切相关。

【关键词】食管鳞状细胞癌; DMBT1; CD44v6;免疫组织化学

项目来源:河北省医学科学研究重点课题计划(编号: 20120271)

E-mail: luowy@126.com

食管癌是我国常见的恶性肿瘤之一，而肿瘤转移是大多数肿瘤患者的重要致死因素。脑恶性肿瘤缺失基因1(deleted in malignant brain tumors 1，DMBT1)是近年来新发现的一种侯选的抑癌基因，它的突变失活与多种肿瘤的发生、发展及转移有密切的关系［1］。CD44v6是一种重要的细胞粘附分子，与多种肿瘤的发生、发展及转移关系密切。我们应用免疫组织化学方法检测食管鳞状细胞癌中DMBT1、CD44v6的表达，探讨DMBT1、CD44v6与食管鳞状细胞癌生物学行为的关系，报告如下。

1　资料与方法

1.1一般资料随机选取河北医科大学第四医院病理科2004年7月至2005年1月经手术切除的食管癌标本70例，其中男37例，女33例;年龄35～78岁，平均年龄(60±7)岁。所有患者术前均未接受过放疗化疗及免疫治疗。全部病例均经病理医师检查证实为食管鳞状细胞癌，并由两位年资较高的病理科医生，根据1990年WHO食管癌的分级标准将70例食管鳞状细胞癌分为高、中、低分化三级，其中高分化鳞癌2例，中分化鳞癌29例，低分化鳞癌15例;有淋巴结转移32例，无淋巴结转移38例;侵及肌层的鳞癌14例侵及外膜层的鳞癌56例。同时取距肿瘤≥5 cm的正常食管黏膜组织23例作对照。术后立即取材，以4%多聚甲醛固定，石蜡包埋，连续切片，片厚4 μm，共3张，用于常规HE染色并行组化检测。

1.2试剂第一抗体DMBT1(H-130) sc-28239兔多克隆抗体由美国Santa Cruz公司出品，CD44v6单克隆抗体和SP-900通用型工作试剂盒均购买于北京中杉生物技术有限公司。

1.3染色方法采用免疫组织化学S-P法。切片经常规脱蜡，用3%过氧化氢去除内源性过氧化物酶的活性，微波炉抗原修复。组化染色按S-P试剂盒提供的说明书进行。用已知阳性切片作对照，用PBS液代替一抗作为阴性对照。

1.4结果判断根据参考文献［2］的方法，DMBT1以细胞浆内出现棕色颗粒判断为阳性，对每张切片随机选取5个高倍视野，每个视野计数200个细胞，共计1 000个，计数阳性细胞并计算其所占比例:阳性细胞＜5%，判定为阴性表达，阳性细胞≥5%，判定为阳性表达。根据参考文献［3］的方法，CD44v6以细胞膜呈现棕黄色颗粒为阳性细胞，阳性细胞＜10%，判定为阴性表达，阳性细胞≥10%，判定为阳性表达。见图1、2。

图1　DMBT1蛋白在高分化鳞癌中的表达，阳性信号定位于细胞浆，角化珠着色明显(SP法×200)

图2　CD44v6蛋白在高分化鳞癌中的表达，阳性信号定位于细胞膜(SP法×200)

1.5统计学分析应用SAS 6.12统计软件，计量资料以±s表示，采用t检验，计数资料采用χ2检验，P ＜0.05为差异有统计学意义。

2　结果

2.1DMBT1、CD44v6在食管黏膜上皮及癌组织的表达DMBT1、CD44v6在23例正常食管鳞状上皮组织中表达强，在癌组织中表达弱或不表达。

2.2食管鳞状细胞癌组织中DMBT1的表达与病理特征的关系DMBT1在癌组织中的表达明显低于在正常食管鳞状上皮组织中的表达，随着分化程度的降低，DMBT1蛋白的表达减弱或不表达(P<0.05)，且DMBT1的表达与淋巴结转移密切相关(P<0.05)，而与浸润深度无关(P＞0.05)。见表1。

2.3食管鳞状细胞癌组织中CD44v6的表达与病理特征的关系CD44v6蛋白的表达与食管鳞状细胞癌的发生和淋巴结转移有关(P<0.05)，而与食管鳞状细胞癌的分化程度、浸润深度无关(P＞0.05)。见表2。

2.4食管鳞状细胞癌中DMBT1与CD44v6的表达与

表1　DMBT1表达与食管鳞癌临床病理特征的关系例(%)

表2　CD44v6表达与食管鳞癌临床病理特征的关系例(%)

肿瘤的生物学行为70例食管癌中，45例CD44v6表达阳性，25例表达阴性。CD44v6阳性组中DMBT1阳性20例，CD44v6阴性组中DMBT1阳性10例CD44v6阳性组中DMBT1阳性表达率与CD44v6阴性组中DMBT1阳性表达率差别无显著意义(χ2=0.13 P＞0.05)。见表3。

表3　DMBT1和CD44v6联合表达与食管鳞癌的关系　例

3　讨论

DMBT1位于人类染色体10q26.13，为近年来新发现的一种候选的抑癌基因，它的表达下调、缺失、突变失活与多种肿瘤，特别是与上皮细胞肿瘤的发生发展密切相关，且与淋巴结转移、肿瘤浸润深度存在明显的相关性［1］。本研究应用免疫组化法检测70例食管癌组织和23例正常食管黏膜上皮组织中DMBT1蛋白的表达，结果显示，DMBT1蛋白在食管鳞状细胞癌中的表达明显低于正常组织，提示DMBT1基因的失活可能与食管鳞癌的发生有关，可能具有抑癌基因对肿瘤负性调控的作用;本研究还发现低分化的癌组织DMBT1的阳性表达率显著低于高分化的癌组织，伴有淋巴结转移的癌组织DMBT1蛋白的阳性表达率显著低于无淋巴结转移组，这说明DMBT1表达的减弱与食管鳞癌分化程度和淋巴结转移有关。肿瘤的淋巴结转移、分化程度都是影响肿瘤预后的因素，因此提示DMBT1在食管鳞癌中可能具有判断预后的价值。

肿瘤转移作为一个相当复杂的过程，不仅与多个癌基因与抑癌基因的改变有关，还与肿瘤细胞的粘附性有关，CD44s是一种细胞表面的跨膜糖蛋白粘附分子，其细胞膜区羧基端通过锚蛋白、埃兹蛋白、膜突蛋白、根蛋白与细胞骨架肌动蛋白相连［4］，细胞膜外区有透明质酸、胶原、纤维连接素、硫酸软骨素的结合点［5］，CD44s通过细胞膜外受体与相应配体的结合参与细胞与细胞、细胞与细胞外基质间特异性粘附过程，另外它还参与淋巴细胞归巢，参与淋巴细胞的激活，以及参与信号转导等功能［6，7］。CD44v6的结构与CD44s的基本结构相似，但在细胞膜外靠近细胞膜区插入了43个由v6变异拼接型外显子所编码的不同序列的氨基酸［8］。近年来发现CD44与多种肿瘤的发生、发展、转移有关。本研究结果表明CD44v6蛋白在食管鳞状细胞癌中的表达明显低于正常组织，说明CD44v6表达下降在食管磷癌的发生中可能有一定的作用;本研究还发现伴有淋巴结转移的癌组织CD44v6蛋白的阳性表达率明显低于无淋巴结转移组，说明CD44v6表达的减弱与肿瘤的淋巴结转移有关。

机体免疫监视系统对控制肿瘤发生、发展起关键作用，进入循环的肿瘤细胞必须逃逸机体的免疫监视杀伤系统，才能得以在继发器官定位生长。DMBT1编码蛋白是SRCR超家族中的新成员，SRCR超家族是免疫球蛋白超家族中具有回忆功能且大多数与免疫系统的增生和分化相关的家族［9－11］。DMBT1SAG(salivary agglutinin)、DMBT1GP340(glycoprotein-340)二者都是DMBT1的剪接形式［12］，分别存在于口腔、呼吸道中，与免疫防御、上皮再生有关。Mollenhauer等［13］研究发现，DMBT1GP340通过与肺泡表面活性蛋白Sp-D (surfactant protein D)、Sp-A作用可刺激肺泡巨噬细胞的迁移。Sp-D、Sp-A已从人类支气管肺泡灌洗液中分离，存在于肺泡巨噬细胞，可诱导肺泡巨噬细胞的活化。本研究发现无论是正常食管粘膜组织还是食管鳞癌组织，其间质中的巨噬细胞和淋巴细胞DMBT1的表达均为强阳性，而CD44v6有参与淋巴细胞的归巢和参与淋巴细胞的激活的作用［6，7］，但DMBT1和CD44v6在免疫系统中的作用是否具有相关性还不明确。

与DMBT1相同基因的选择性拼接的兔的hensi蛋白，能够诱导微绒毛蛋白的表达，而导致尖端终端网状蛋白(细胞角蛋白19和肌动蛋白)的出现［14］CD44s细胞膜区羧基端通过锚蛋白、埃兹蛋白、膜突蛋白、根蛋白与细胞骨架肌动蛋白相连［4］，但DMBT1蛋白与CD44v6的关系还不明确。目前也没有DMBT 和CD44v6相互关系的报道，本研究中虽然DMBT1和CD44v6的表达并无相关性，但都与食管鳞状细胞癌的发生和转移有关。因此DMBT1和CD44v6可共同作为判断食管鳞状细胞癌转移和预后的指标。

参考文献

1Mollenhauer J，Wiemann S，Scheurlen W，et al.DMBT1，a new member the SRCR superfamily，on chromosome 10q25.3-26.1 is deleted in ma lignant brain tumors.Nat Genet，1997，17: 32-39.

2Sasaki M，Huarg SF，Chen MF，et al.Expression of deleted in malignan brain tumor-1 (DMBT1) molecule in biliary epithelium is augmented i hepatolithiasis: Possible participation in lithogenesis.Digestive Disease and Sciences，2003，48: 1234

3陈海霞，武培敬，许艳梅，等.CD44v6、EGFR及nm23-H1基因蛋白在食管鳞癌组织中的表达及意义.肿瘤防治研究，2003，30: 388-390.

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7Haynes BF，Telen MJ，Hale LP，et al.CD44-a molecule involved in leu kocyte adherence and T-cell activation.Immunol Today，1989，10: 423.

8Underhill CB，Gress SJ，Tarone P.The hyaluronate receotor is identical t a glycoprotein of Mr 85000(gp85) as show by a monoctonal antibody th interferes with binding activity.J Biol Chem，1987，262: 1312-1314.

9Rasheed BK，Mclendon RE，Firedman HS，et al.Chromosome 10 deletio mapping in human gliomas: a common deletion region in 10q 25.Onco gene，1995，10: 2243-2246.

10Uurich A，Sures I，Degidio M，et al.The secreted tumor-associated anti gen 90k is a potent immune stimulator.J Biol Chem，1994，269: 18401 18407.

11Law SK，Mickem KJ，Shaw JW，et al.A new macrephage differentiatio antigen which is a member of the scavenger receptor superfamily.Eur Immunol，1993，23: 2320-2325.

12Bikker FJ，van der Wal JE，ligtenberg AJ，et al.Salivary agglutinin DMBT1SAG expression is up regulated in the presence of salivary glan tumors.J Dent Res，2004，83: 567-571.

13Mollenhauer J，Herbertz S，Holmskov U，et al.DMBT1 encodes a protei involved in the immune defense and in epithelial differentiation andi highly unstable in cancer.Cancer Res，2000，60: 1704-1710.

14Al-Awqati Q，Vijayakumar S，Takito J，et al.Phenotypic plasticity an terminal differentiation of the intercalated cell: the hensin pathway.Ex Nephrol，2000，8: 66-71.

Expression and biological significance of DMBT1，CD44v6 in esophageal squamous cell carcinoma

LUO Wenyan*， CHENG Yuan*，HU Aiyuan，et al.*
Department of Pathology，College of Basic Medicine of Hebei TCM College，Shijiazhuang 050200，China

【Abstract】Objective To investigate the expression of DMBT1，CD44v6 in esophageal squamous cell carcinoma，and to explore the correlation between their expressions and the biological behavior of tumors.Methods The expression levels of DMBT1 and CD44v6 were detected by immunohistochemistry (IHC) in 70 cases of esophageal squamous cell carcinoma and 23 cases of incisal margin normal tissues.Results The expression levels of DMBT1 and CD44v6 in esophageal squamous cell carcinoma were decreased or negative.The expression levels of DMBT1 were related with histological differentiation degree，lymph node metastasis of esophageal squamous cell carcinoma (P<0.05)，however，which were not associated with infiltration depth of tumor tissues (P＞0.05).The expression levels of CD44v6 were correlated to lymph node metastasis (P ＜0.05)，however，which were not related with histological differentiation degree and infiltration depth of tumor tissues (P＞0.05).ConclusionThe decrease of DMBT1expression may be the biological markers of poor differentiation and higher malignancy degree of esophageal squamous cell carcinoma tissue，moreover，which is closely correlated to lymph node metastasis of tumor.The expression levels of CD44v6 are related with the pathogenesis and lymph node metastasis of esophageal squamous cell carcinoma.

【Key words】esophageal squamous cell carcinoma; DMBT; CD44v6; immunohistochemistry

(收稿日期:2014－10－27

通讯作者:左连富，050051河北医科大学肿瘤研究所;

doi:10.3969/j.issn.1002－7386.2015.09.002

【文章编号】1002－7386(2015) 09－1290－03

【文献标识码】A

【中图分类号】R 735.1