真核表达质粒pSG.SS.C3d3.YL.Bin1b雄鼠免疫避孕效应研究

周青松，靳风烁，李彦锋，张 军，张克勤，孙中义

(第三军医大学大坪医院野战外科研究所泌尿外科，重庆 400042)

·基础研究·

真核表达质粒pSG.SS.C3d3.YL.Bin1b雄鼠免疫避孕效应研究

周青松，靳风烁，李彦锋，张 军，张克勤，孙中义

(第三军医大学大坪医院野战外科研究所泌尿外科，重庆 400042)

目的 研究小鼠Bin1b真核表达重组质粒pSG.SS.C3d3.YL.Bin1b的DNA疫苗雄鼠免疫避孕效应。方法 应用pSG.SS.C3d3.YL.Bin1b(C3d3-Bin1b组)肌注免疫雄鼠，观察其精子活力及避孕效应，ELISA法检测雄鼠血清抗Bin1b蛋白IgG抗体最大稀释度、IL-2、INF-γ、IL-4、IL-10水平。PBS组、空载体pSG.SS.YL组(空载体组)和pSG.SS.YL.Bin1b组(Bin1b组)为对照组。结果 C3d3-Bin1b组雄鼠精子活力、雌鼠受孕率、平均产仔数量显著降低，免疫避孕效果显著好于Bin1b组。C3d3-Bin1b组雄鼠血清抗Bin1b蛋白IgG抗体滴度显著升高，血清IL-2、INF-γ浓度显著降低，血清IL-4、IL-10浓度显著增加。结论 真核表达重组质粒pSG.SS. C3d3.YL.Bin1b可有效诱导雄鼠产生免疫性避孕效应，效果优于pSG.SS.YL.Bin1b。

抗菌肽蛋白；避孕疫苗；C3d3

雄性免疫节育疫苗的开发可能成为控制人口过度增长的理想措施，而靶抗原的选择及增强免疫效应的有效途径则是构建该类疫苗的最关键部分。附睾对精子具有促进成熟、储存和保护作用，目前认为附睾是进行抗生育的一个理想的靶器官[1-2]，因为附睾功能较为单一，药物不致引起严重的副作用，而且精子在进入附睾前已经分化完全，不涉及DNA复制机能，干扰药物不会引起DNA改变的遗传病。目前认为附睾头部中段上皮细胞所分泌的抗菌肽蛋白(Bin1b)“启动”了精子的前向运动，促进精子的成熟，进行这一功能的阻断研究可能是雄性免疫节育的关键点[3-4]。研究表明，2～3个补体C3裂解片段(C3d)拷贝能显著提高抗原免疫原性[5-6]。因此，本研究制备含有小鼠Bin1b和串联3个C3d(C3d3)融合基因的真核重组表达质粒pSG. SS.C3d3.YL.Bin1b，将该DNA疫苗接种于雄性昆明小鼠，观察其免疫性避孕效应。

1 材料与方法

1．1 质粒、动物和仪器质粒pSG.SS.C3d3.YL.Bin1b和pSG.SS.YL.Bin1b为本课题组前期构建。昆明小鼠雄性24只，雌性72只，均为8周龄以上有生育能力的健康成年鼠，每只小鼠体重为20～22 g。96孔酶标板(丹麦NUNC)，酶联免疫检测仪(美国 Biorad)。

1．2 方法及检测

1．2．1 小鼠免疫程序 随机将24只雄性小鼠分为4组，pSG.SS.YL-Bin1b组(Bin1b组)、pSG.SS.C3d3.YL-Bin1b组(C3d3-Bin1b组)、空载体pSG.SS.YL(空载体组)和 PBS阴性对照组(PBS组)，每组6只。C3d3-Bin1b组用质粒pSG.SS.C3d3.YL-Bin1b注射股四头肌，轮流注射两侧肢体，初免及加强(0、2、4周)共3次，每次接种DNA量100 pmol/100 μL。等量无菌 0.01 mol/L PBS注射PBS组，用空载体pSG.SS.YL对空载体组进行免疫，Bin1b组用pSG.SS.YL-Bin1b进行免疫。

1．2．2 免疫避孕效应观察 把免疫后6周的各组雄鼠与同龄健康有生育力的雌鼠合笼喂养，雌雄鼠合笼比例为3∶1，若合笼雌鼠出现有阴道栓，则立即分笼喂养雌鼠，统计各组孕鼠数量及每窝产仔数量。

1．2．3 标本采集 取各组小鼠初次免疫后2、4、8周断尾血15 μL，混入 30 μL阿氏保存液，4℃静置3 h，离心(1 000 r/min×5 min)后取上清液，在-70 ℃冰箱中保存，用于抗体检测。首次免疫后第8周处死雄鼠，体表酒精消毒，解剖雄鼠，取出双侧附睾尾，放入生理盐水中，清理表面血污及脂肪。将附睾尾置于培养皿液滴中央，切碎附睾采集精子，精子悬液立即进行显微观察与活力计数。

1．2．4 血清Bin1b抗体检测 采用ELISA分析法检测抗体浓度， A背景值为PBS组血清稀释10倍所测值，超过A背景值3倍为阳性，抗体滴度为稀释血清至非阳性范围内的终末稀释值。

1．2．5 血清IL-2、INF-γ、IL-4、IL-10水平测定 按ELISA试剂盒说明书操作(美国R&D公司)。

1．3 统计分析应用软件SPSS18.0进行统计分析，P<0.05差异显著，P<0.01差异非常显著。

2 结 果

2．1 免疫性避孕效应观察与两对照组相比，C3d3-Bin1b组和Bin1b组雌鼠受孕率、平均产仔数量均显著降低，雄鼠精子活力显著下降，C3d3-Bin1b组变化趋势较Bin1b组显著(见表1)。

组别雌鼠受孕率(%)每胎产仔数(只)雄鼠精子活力(%)PBS组10011.3±2.182.6±5.5空载体组10010.9±2.882.3±5.8Bin1b组 55.6*5.9±1.2*42.5±6.6*C3d3-Bin1b组 27.8△3.4±1.1△27.1±9.3△

与PBS组、空载体组比较，*P<0.01;与其他三组比较,△P<0.01

2．2 雄鼠血清抗Bin1b抗体生成情况测定Bin1b组和C3d3-Bin1b组首次接种后2、4、8周均出现抗体阳性反应。Bin1b组最大稀释度分别为1∶20、1∶80和1∶640，C3d3-Bin1b组最大稀释度分别为1∶80、1∶320和1∶2 560，显著高于同期Bin1b组。PBS组和空载体组均未出现阳性反应。

2．3 雄鼠血清IL-2、INF-γ、IL-4、IL-10水平测定结果IL-2和INF-γ质量浓度在Bin1b组和 C3d3-Bin1b组呈降低趋势，并且C3d3-Bin1b组显著低于Bin1b组，PBS组和空载体组无显著区别。IL-4和IL-10浓度在Bin1b组和 C3d3-Bin1b组呈升高趋势， Bin1b组显著低于C3d3-Bin1b组(表2～表5)。

组别2周 4周 8周 PBS组37.7±3.636.6±3.436.9±2.9空载体组36.8±2.836.2±3.136.3±2.8Bin1b组31.5±2.8*28.4±3.2*25.2±3.5*C3d3-Bin1b组25.6±2.7△22.4±2.6△18.1±1.4△

与PBS组、空载体组比较,*P<0.01;与其他3组比较,△P<0.01。

组别2周 4周 8周 PBS组9.15±0.629.02±0.849.10±0.51空载体组9.12±0.389.08±0.698.92±0.95Bin1b组8.04±0.55*7.13±0.45*5.94±0.68*C3d3-Bin1b组5.81±0.39△4.95±0.47△4.56±0.34△

与PBS组、空载体组比较,*P<0.01;与其他3组比较,△P<0.01。

组别2周 4周 8周 PBS组49.2±5.148.8±4.148.5±5.0空载体组49.1±3.049.3±3.850.9±4.2Bin1b组58.4±4.2*63.2±7.1*68.2±4.3*C3d3-Bin1b组68.7±5.1△74.1±4.9△79.5±5.5△

与PBS组、空载体组比较,*P<0.01;与其他3组比较,△P<0.01。

组别2周 4周 8周 PBS组30.9±3.831.1±3.330.2±3.8空载体组30.8±3.531.5±2.228.9±3.9Bin1b组39.3±4.6*44.0±5.3*50.1±3.4*C3d3-Bin1b组47.3±5.2△51.9±6.5△56.8±5.6△

与PBS组、空载体组比较，*P<0.01;与其他3组比较,△P<0.01。

3 讨 论

抗菌肽蛋白(Bin1b)为附睾头部中段的上皮细胞分泌的一种蛋白，它被分泌入管腔后，结合没有运动能力的精子，使精子通过L型钙离子通道摄取钙离子，进一步促进了精子运动。前期研究也发现，将未成熟的附睾头部精子和转染Bin1b的小肠上皮细胞或附睾头部上皮细胞(含Bin1b)共培养，精子运动加强，但在加入Bin1b抗体后，精子的运动能力无变化；此外，向成熟的附睾尾部精子中加入Bin1b抗体后，没有改变精子的运动能力。说明Bin1b对成熟精子的运动不起作用，但是能促进未成熟精子的运动[7]。

本研究组在前期实验中成功构建了pSG.SS.C3d3.YL.Bin1b重组真核表达质粒，本实验进一步研究了重组质粒DNA疫苗雄鼠免疫避孕效应，采用的方法是DNA疫苗注射。相比传统疫苗，DNA疫苗具有高效、持久、简便、广谱、廉价、无致病性等突出的优势。

本研究结果表明，pSG.SS.C3d3.YL.Bin1b DNA疫苗免疫雄性小鼠后，精子活力、雌性小鼠受孕率、平均产仔数量显著降低，其避孕效应显著优于Bin1b组。雄鼠在未加强免疫时，血清中就已产生Bin1b特异性抗体，而且滴度逐渐升高。机体在抗原刺激后，会产生相应的体液或细胞免疫应答，判断免疫应答类型的主要依据是抗原刺激机体后导致细胞因子微环境的改变。前期研究发现，C3d作用机制与以下因素有关：① 补体C3是补体激活途径中的枢纽，并保持与抗原共价连接的能力[8]。②C3d通过与抗原耦联，增加抗原分子量，提高低亲和性/小分子量抗原的免疫原性[9]。③B细胞表面的CR2/ CD21和BCR分别与耦连的C3d和抗原结合，使BCR与 CD19交联，从而直接将免疫效应细胞与抗原相连，产生共刺激信号[10]。

精浆中含有IL-1、IL-2、IL-6、IL-8、IL-10、IL-11、IL-12、肿瘤坏死因子、干扰素等多种细胞因子, 它们对精子的发生和功能等发挥着直接和间接的生物学作用[11], 从而对男性生育产生影响。IL-2 和IL-4 均由活化的辅助性T 细胞(Th) 分泌, 其中Th1 分泌IL-2，Th2 分泌IL-4, 在正常情况下，Th1 和Th2 维持一定平衡, 在T 细胞、B 细胞、巨噬细胞的增殖分化及功能调控方面起重要调节作用。IL-2最重要的作用是诱导T淋巴细胞增殖(从G0期进入S期)和分化。其对T细胞的作用还包括增强细胞毒性T淋巴细胞(CTL)的细胞毒活性，增加细胞内pH，诱导c-myc、c-myb和IL-2受体表达，促进细胞移动，增强细胞间的接触和诱导细胞分泌细胞因子干扰素(IFN)-7、IL-4、TNF和集落刺激因子CSF等。本实验中，对相关细胞因子检测后发现，IL-2和INF-γ浓度在C3d3-Bin1b组呈降低趋势，表明C3d3能显著增强Bin1b疫苗免疫原性，抑制IL-2、IL-4和INF-γ的生物活性，进而抑制精子细胞活力。C3d对Bin1b具有显著调节作用。相对与Bin1b组，IL-4和IL-10浓度在C3d3-Bin1b组呈升高趋势， IL-2和INF-γ浓度在C3d3-Bin1b组呈降低趋势，表明C3d3能显著增强Bin1b疫苗免疫原性，诱导更强免疫反应。

综上所述，pSG.SS. C3d3.YL.Bin1b DNA疫苗可有效诱导雄鼠产生免疫性避孕效应，效果显著优于pSG.SS.YL.Bin1b。

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(编辑 王 玮)

Immunocontraceptive effects of pSG.SS.C3d3.YL.Bin1b on male mice

ZHOU Qing-song, JIN Feng-shuo, LI Yan-feng, ZHANG Jun, ZHANG Ke-qin, SUN Zhong-yi

(Department of Urology, Research Institute of Surgery, Daping Hospital, Third Military Medical University, Chongqing 400042, China)

Objective To explore the immunological contraceptive effects induced by pSG.SS.C3d3.YL.Bin1b on male mice. Methods After male mice were immunized with pSG.SS.C3d3.YL.Bin1b,their serum IgG titres against Bin1b,the content of serum IL-2,INF-γ,IL-4 and IL-10 were detected using ELISA assays.PBS group, pSG.SS.YL group and pSG.SS.YL.Bin1b group (Bin1b group) served as control groups. Results The sperm viability, pregnancy rate of the female mice,and average litter number of the C3d3-Bin1b group were significantly lower than those of the Bin1b group.In the C3d3-Bin1b group,serum IgG titres was higher, the content of IL-2 and INF-γ decreased significantly, while the content of IL-4 and IL-10 increased markedly.Conclusion pSG.SS.C3d3.YL.Bin1b has better contraceptive effects on male mice than pSG.SS.YL.Bin1b.KEY WORDS:Bin1b; contraception vaccine; C3d3

2014-07-09

2014-11-07

国家自然科学基金(No.81100546)；重庆市自然科学基金(No.CSTC,2010BB5162)

孙中义，副主任医师、副教授.E-mail: sun200801@hotmail.com

周青松(1984-),男(汉族)，硕士，住院医师，主要从事男科学基础和临床研究.E-mail: lobsper.j@163.com

R392

A

10.3969/j.issn.1009-8291.2015-03-016