葆青口服液抗D-半乳糖致大鼠皮肤衰老的实验

王蒙蒙，翟晓翔

(1.南京中医药大学，江苏南京210046；2.南京中医药大学附属徐州市中医院，江苏徐州221000)

葆青口服液抗D-半乳糖致大鼠皮肤衰老的实验

王蒙蒙1，2，翟晓翔2

(1.南京中医药大学，江苏南京210046；2.南京中医药大学附属徐州市中医院，江苏徐州221000)

目的 探讨葆青口服液抗皮肤衰老的作用机制。 方法 清洁级成年SD雌性大鼠每日颈背部皮下注射20%的D-半乳糖1000 mg/(kg/d)造成大鼠衰老模型，2周后治疗组分别灌服葆青口服液0.01 mL/(g/d)、戊酸雌二醇0.01 mL/(g/d)、当归芍药散水煎剂0.01 mL/(g/d)，42 d后测定大鼠皮肤组织含水量、羟脯氨酸、大鼠血清雌二醇(E2)含量，考察其对大鼠子宫指数及卵巢指数的影响。 结果 与模型组比较，治疗组大鼠皮肤组织含水量、羟脯氨酸、雌二醇含量明显升高(P<0.01)，各指标改善程度葆青口服液组明显优于当归芍药散水煎剂组，对大鼠子宫指数、卵巢指数有明显提高作用(P<0.01)。 结论 葆青口服液对D-半乳糖致衰老大鼠皮肤有明显的抗衰老作用，其作用与延缓卵巢衰老有关。

葆青口服液；当归芍药散；皮肤衰老；D-半乳糖；抗皮肤衰老；作用机制

葆青口服液以张仲景《金匮要略》中的当归芍药散为基础方，经现代工艺改良，添加胶原蛋白等功能性辅料制成。当归芍药散养血调肝，健脾渗湿，为调和肝脾方。随着现代医学研究的深入，当归芍药散逐渐被用于治疗神经系统疾病、心系疾病、消化系统疾病、外科杂症、皮肤病等。20世纪80年代，日本学者首次用当归芍药散治疗老年痴呆症疗效显著，此后其抗衰老的机制及应用得到重视。为探讨葆青口服液抗皮肤衰老的作用机制，我们采用D-半乳糖制作皮肤衰老大鼠模型，观察其对皮肤衰老的影响，现报道如下。

1 实验材料

1.1 实验动物 清洁级，8～12周龄，雌性，SD大鼠40只，体质量180～220 g，徐州医学院基础医学院实验动物中心提供，合格证号：SCXK苏2011-0003。饲养于徐州医学院基础医学院实验室，温度23～25℃，相对湿度50%～60%，自由进水、进食。

1.2 药物和试剂 葆青口服液(当归9 g，白芍30 g，茯苓12 g，白术12 g，泽泻15 g，川芎9 g，胶原蛋白多肽)，由华南农业大学食品工程学院加工。当归芍药散常规煎服的水煎剂(当归9 g，白芍30 g，茯苓12 g，白术12 g，泽泻15 g，川芎9g)，徐州中医院药剂科提供。戊酸雌二醇片(DELPHARM Lille S.A.S.，批号：国药准字J20130009)，1 mg/片，溶于100 mL生理盐水中制成浓度为0.01 mg/mL的溶液；D-半乳糖(上海源叶生物科技有限公司)；血清雌二醇放免测定试剂盒(北京华英生物技术研究所)；羟脯氨酸(hydroxyproline，HPY)试剂盒(南京建成生物有限公司)。

1.3 主要器材和仪器 JA2003N电子天平(上海佑科仪器仪表有限公司)；ZW-A微量振荡器(苏州威尔实验用品有限公司)；KDC-40低速离心机(安徽中科中佳科学仪器有限公司)；Bio Tek全自动酶标仪、DHG-9246A电热恒温鼓风干燥箱、DK-8D电热恒温水槽(上海精宏实验设备有限公司)；Thermo Scientific Forma 900 Series超低温冰箱、立鹤牌电热恒温培养箱(山东潍坊精鹰医疗器械有限公司)。

2 实验方法

2.1 动物分组 将筛选合格的大鼠随机分为5组，每组8只，空白对照组按1 mL/(200 g/d)颈背部皮下注射生理盐水，其它4组用20%的D-半乳糖生理盐水溶液，按1 000 mg/(kg/d)颈背部皮下注射，每日1次，2周后空白组及模型组灌服生理盐水0.01 mL/ (g/d)，葆青口服液组按0.01 mL/ (g/d)给大鼠灌服。戊酸雌二醇溶液按0.01 mL/(g/d)给大鼠灌服，当归芍药散水煎剂组按0.01 mL/ (g/d)，连续42 d，注射按无菌操作进行。

2.2 取材及指标测定 实验结束前1天，4组大鼠禁食1 d，并选取大鼠背部脱毛，先用剪刀剪去鼠背上的粗毛，再用一次性备皮刀将剩余的绒毛剃除干净，使背部皮肤充分暴露，面积2 cm×3 cm。

2.2.1 取材 用10%水合氯醛3～4 mL/kg腹腔注射麻醉，用采血针和真空采血试管在腹主动脉处取全血3～5 mL，将血液迅速放入37℃电热恒温培养箱，4℃、3 000 r/min离心10 min，提取血清，放入-70℃冰箱保存备用。采血结束后，立即解剖大鼠，取出双侧卵巢及子宫，剔除附着的脂肪组织，用滤纸擦拭，吸取表面的血液，保证卵巢及子宫的完整和清洁，并迅速剪取大鼠背部脱毛处的全层皮肤适量(不含皮下脂肪)，分2份，1份1 cm×1 cm待测皮肤湿重，1份精确称取皮肤组织湿重30～50 mg，按试剂盒说明书要求用碱水样法测羟脯氨酸含量。

2.2.2 雌二醇测定 采用放射免疫法测定大鼠血清E2的水平。

2.2.3 子宫、卵巢指数测定 用电子天平精密称取各大鼠剔除脂肪后的两侧子宫和卵巢的湿重，并记录，按以下公式计算子宫指数和卵巢指数。

子宫指数=子宫湿重/体重×100%

卵巢指数=卵巢湿重/体重×100%

2.2.4 对皮肤组织含水量的影响 用电子天平精密称取每只大鼠背部全层皮肤的湿重，记录并标号，随即将其放入烘箱中，于80℃烘干24 h，再称取其干重。计算皮肤含水百分率。

含水百分率=(湿重-干重)/湿重×100%

3 结 果

实验结果 见表1、表2。

表1 葆青口服液对大鼠血清E2、子宫指数、卵巢指数的影响

注：与模型组比较，1)P<0.01；与当归芍药散组比较，2)P<0.01，3)P<0.05。

表2 葆青口服液对大鼠皮肤组织含水量及羟脯氨酸的影响

注：与模型组比较，1)P<0.01；与当归芍药散组比较，2)P<0.01，3)P<0.05；与雌二醇组比较，4)P<0.05。

4 讨 论

4.1 雌激素能促进表皮增殖，抑制角质细胞凋亡；增加胶原蛋白含量，抑制基质金属蛋白酶的表达，减少胶原的降解，增加透明质酸和酸性黏多糖含量，保持皮肤厚度、弹性、水分及屏障功能[1]；并参与机体抗氧化反应，通过多种途径达到抗皮肤衰老的作用。然而，雌激素替代疗法能增加宫内膜癌、乳腺癌等的发病率，有较大的副作用[2-5]，不作为延缓皮肤衰老的首选。研究发现，当归芍药散除了具有清除自由基、抗氧化、调节血液及免疫系统等功能外，还具备良好的雌激素作用，能调控下丘脑-垂体-卵巢轴，抗皮肤衰老。

4.2 葆青口服液组与当归芍药散组比较，对于大鼠血清E2、卵巢指数、子宫指数、皮肤组织含水量、羟脯氨酸含量的改善更明显。说明葆青口服液能调节卵巢衰老大鼠模型的性激素水平，明显升高血清E2水平，提高卵巢及子宫指数，延缓卵巢衰老，从而达到抗皮肤衰老的作用。

4.3 葆青口服液以当归芍药散为基础，添加功能性辅料，采取现代工艺提取中药的活性成分，浓缩药物，过滤杂质，矫正苦涩味，是口感良好、携带方便的中药复方制剂。当归芍药散组方严谨，重用芍药，养血柔肝，缓急止痛，配当归、川芎助其养血活血以调肝，三药配合达到养肝、柔肝、疏肝之目的，防止皮肤衰老。另一方面白术健脾益气，配茯苓、泽泻渗湿力强，助其健脾祛湿，达到脾胃健运而充养肌肤。本方养血疏肝与健脾渗湿同行，肝脾共调，使气血运行流畅，则可延年悦面，益颜展皱，乃驻颜美容、延缓皮肤衰老之要方。另外，葆青口服液中增加的胶原蛋白多肽，可以有效地提高角质层含水量、透明质酸的合成、防止皮肤干燥、改善面部肤质等。

[1]SON E D，LEE J Y，LEE S，et al. Topical application of 17beta-estradiol increases extracellular matrix protein synthesis by stimulating tgf-Beta signaling in aged human skin in vivo[J]. J Invest Dermatol，2005，124(6)：1149-1161.

[2]BAKKEN K，ALSAKER E，LUND E，et al. Hormone replacement therapy and incidence of hormone-dependent cancers in the Norwegian Women and Cancer study[J]. Int J Cancer，2004，112(1)：130-134.

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[4]HENDERSON B E，ROSS R K，PIKE M C. Hormonal chemoprevention of cancer in women[J]. Science，1993，259(5095)：633-638.

[5]李洁，杨菁，陈媛，等. 利用不同浓度D(+)半乳糖建立卵巢早衰动物模型[J]. 武汉大学学报:医学版，2006，27(5)：613-619.

2015-05-10

R285.5

A

1000-338X(2015)03-0052-02