低聚木糖-脯氨酸美拉德反应衍生物的制备及其抗氧化性能*

张亦鸣，谢晶，薛斌，周冬香，邵则淮，胡月华，孙涛

(上海海洋大学食品学院，上海水产品加工储藏工程研究中心，上海，201306)

木糖是一种广泛存在于自然界的植物纤维素，由木糖分子以β-1，4糖苷键连接而成［1］。它具有低热量、改善人体的微生物环境，提高机体免疫力的功效［2-5］。作为木糖的寡聚糖，低聚木糖(xylo-oligosaccharide，XO)由 2 ～7 个木糖分子结合而成［6］，它可增加肠道内双歧杆菌数量，对巨噬细胞、淋巴细胞有吞噬能力，可直接杀伤肿瘤细胞，增强机体免疫能力［7-9］。此外，低聚木糖可显著降低血压、血清胆固醇，并有效控制血糖水平，具有非常高的医疗保健价值。

化学改性是赋予多糖活性的重要手段［10-11］，但往往会引入杂质和副产物。美拉德反应(Maillard reaction)是伴随着食品加工、生产、贮藏过程中常见的反应，是一种安全可靠的多糖改性手段［12-13］。

作为潜在的食品保鲜剂，木糖-壳聚糖美拉德共聚物［3］具有良好的抗菌性、抗氧化性;木糖-甘氨酸美拉德反应产物［4］具有很好的Fe2+螯合能力，可降低油脂过氧化值(POV);在半干面中添加0.35%木糖-壳聚糖美拉德反应产物［5］，其货架期可延长7 d。具有上述活性的为木糖美拉德反应产物，其中包含小分子醛酮类等易挥发物质，而以美拉德反应为改性手段，对其衍生物的活性与结构关系研究还较为罕见。

本文以美拉德反应为改性手段，制备低聚木糖美拉德衍生物，考察其抗氧化能力，为低聚木糖化学改性提供参考。

1 材料与方法

1.1 材料

低聚木糖(≥95%)，生化级，购自上海金穗生物科技有限公司;鲁米诺、DPPH，Sigma公司;其余试剂均为分析纯，国药集团化学试剂有限公司。抗氧化测试所需溶液，由二次蒸馏水配制。

WFZ UV2000型紫外分光光度计(上海合利仪器有限公司);岛津RF-530 PC荧光分光光度计(日本岛津公司);Delta 320型 pH计(梅特勒-托利多仪分析仪器上海有限公司);FTIR-650傅立叶变换红外光谱仪(天津港东科技发展股份有限公司);IFFM-D型流动注射化学发光分析仪(西安瑞迈科技有限公司);METTLER AE200型电子分析天平;JI80-2B型台式离心机。

1.2 低聚木糖美拉德反应衍生物的制备

称取低聚木糖10.0 g，加入7.7 g脯氨酸，使得羰基和氨基的摩尔质量比为1∶1，用100 mL的二次蒸馏水溶解，在100℃条件下冷凝回流反应。监测反应过程中pH、吸光度以及荧光值的变化，并用丙酮分离提取5、15和30 h低聚木糖美拉德衍生物，记为XP-5h、XP-15h 和 XP-30h。

1.3 测试表征

红外光谱在FTIR-650傅立叶变换红外光谱仪上进行，采用KBr压片法制样，测定波数范围为500～4 000 cm-1，分辨率为 4 cm-1。

产物的相对平均分子质量及其分布采用GPC法测定。GPC测试条件如下:流动相:0.2 mmol/L醋酸钠和醋酸缓冲溶液，pH4.80;监测器:Waters 2410示差折光监测器;柱子:TOSOH BIOSEP TSKGelG4000SWXL:温度:40℃;标准物质为:葡聚糖，(分子质量:473 000、188 000、76 900、43 200、10 500、4 440 Da)。

1.4 抗氧化性能测定

1.4.1 对DPPH自由基(DPPH·)的清除作用［14］

在装有2.0 mL的浓度为1×10-4mol/L DPPH无水乙醇溶液的比色管中，加入不同浓度的样品溶液2.0 mL，摇匀，33℃避光静置0.5 h，在517 nm处测量吸光度Ai。用去离子水代替样品溶液，得吸光度A0，无水乙醇代替DPPH，得吸光度Aj。

清除率/%=(1-(Ai-Aj)/A0)×100

1.4.2 对超氧阴离子自由基(O2-·)的清除作用［15］

1.5×10-3mol/L的鲁米诺溶液用0.05 mol/L的Na2CO3-NaHCO3缓冲溶液(pH10.20)配制，0.1 mol/L的邻苯三酚储备液用1×10-3mol/L的HCl配制，使用前用去离子水稀释至1×10-4mol/L。使用缓冲液作为溶剂，配制不同浓度的样品溶液。采用流动注射化学发光分析仪来测定样品溶液的峰面积，具体如下:蠕动泵分别泵入鲁米诺、缓冲溶液以及邻苯三酚，在流通池中产生化学发光，记录发光信号强度，以峰面积定量。经SOD、过氧化氢酶以及甘露醇检测，该体系产生的自由基为超氧阴离子O2-·。

式中:A0为空白溶液峰面积;Ai为样品溶液峰面积。

1.4.3 还原能力的测定［16］

取2.0 mL不同浓度的样品，加入0.2 mol/L磷酸缓冲液(pH 6.60)和1%铁氰化钾溶液各2.5 mL，混匀，50℃水浴20 min后迅速冷却，加入10%三氯乙酸溶液2.5 mL，混匀后在3 000 r/min下离心10 min，取上清液2.0 mL，加入2.5 mL去离子水和0.5 mL 0.1%的FeCl3溶液，静置10min后在700 nm处测定吸光度。

1.5 数据统计

所有实验重复3次，最终数据为3次实验数据的算术平均值。两组间比较采用t检验(P＜0.05)。

2 结果与讨论

2.1 pH值的变化

低聚木糖与脯氨酸美拉德反应过程中的pH变化如图1所示。反应体系的初始pH呈弱酸性，随着反应的推进，反应物pH逐渐降低，说明反应中生成羟甲基糠醛等酸性物质，这与文献中的结论一致［17］。

2.2 UV-Vis吸光度的变化

美拉德反应中期，会生成无色小分子中间体，如:Amadori重排产物裂解的丙酮醛、丁二酮、丙酮醇等，以及它们在Strecker降解后生成的小分子醛类，这些中间体在295 nm处有紫外吸收;其后反应物经过环化、降解、缩合等，形成褐色产物，在420 nm处有可见光吸收［18］。紫外-可见吸收值越高，美拉德反应就越充分，由此可衡量反应的进程。图2为低聚木糖与脯氨酸美拉德反应过程中紫外-可见吸光度的变化。由图可知，随着反应时间延长，295 nm处紫外吸收增加，说明反应中生成了越来越多的小分子醛类物质;在440 nm处的可见光吸收值也在增加，反应物褐色程度加深。

2.3 荧光值的变化

由于美拉德反应产物，如:羧甲基赖氨酸、戊糖苷素、精氨嘧啶等，具有自发荧光的特性，当受到300～420 nm的入射光激发后，在420～600 nm会产生荧光光谱［19］，化学结构不同的美拉德反应产物，其荧光光谱特征不同。图3为低聚木糖与脯氨酸美拉德反应过程中，在激发波长为370 nm、发射波长为440 nm处荧光值的变化。由图可知，随着反应推进，荧光值增加，说明反应中生成了越来越多的荧光物质。

2.4 低聚木糖美拉德产物的结构表征

图4为低聚木糖、脯氨酸及其美拉德反应衍生物的红外谱图。低聚木糖在3 413 cm-1处的吸收峰是-OH的伸缩振动吸收峰，2 923 cm-1处的吸收峰是C-H的伸缩振动吸收峰，1 636 cm-1处的吸收峰是-OH的弯曲振动吸收峰，而在1 032 cm-1处的吸收峰，则是醇羟基的变角振动吸收峰，在892 cm-1处存在型糖苷键的特征吸收峰，与文献相符［2］;脯氨酸在3 433 cm-1处的吸收峰是水分子-OH的伸缩振动吸收峰，3 062 cm-1处的吸收峰为-NH2+的N-H伸缩振动峰，1 623 cm-1为羧基中C-O双键的伸缩振动峰，而1 380 cm-1处为羧基中C-OH中C-O单键的伸缩振动。美拉德反应后的衍生物c，d，e保留了低聚木糖2 923 cm-1处C-H的伸缩振动吸收峰，1 032 cm-1处醇羟基的变角振动吸收峰，以及892 cm-1附近的多糖特征吸收带;而脯氨酸3 062 cm-1处的-NH2+的N-H伸缩振动峰消失，说明反应部位在此处;衍生物保留了脯氨酸的1 623 cm-1峰和1 380 cm-1峰，说明衍生物中含有羧基。

GPC法测得低聚木糖的相对分子质量为3 879，低聚木糖衍生物XP-5h、XP-15h和XP-30h的相对分子质量为3 925、4 044和4 071，衍生物的相对分子质量都有所增加，且随着反应时间增加，分子质量逐渐增大，表明低聚木糖分子中的羰基与脯氨酸的游离氨基反应，生成了更大的分子。

2.5 对DPPH·的清除

DPPH·是一种很稳定的氮中心的自由基，广泛用于定量测定生物试样和食品的抗氧化能力［20］。DPPH·在乙醇溶液中呈深紫色，在517 nm处有最大吸收峰，当有自由基清除剂存在时，其单电子被结合而使其颜色减褪，在最大吸收波长处的吸光度减小，减小的程度与清除剂的清除能力及其数量呈定量关系。图5描述了低聚木糖衍生物对DPPH·的清除能力。由图5可知，XP-30h，XP-15h和XP-5h的IC50(对自由基清除率为50%时所需要的自由基清除剂浓度)分别为0.046、0.080和0.085 mg/mL，衍生物对DPPH·的清除能力强弱顺序为XP-30h＞XP-15h＞XP-5h，即随着反应进行，低聚木糖美拉德反应衍生物对DPPH·的清除能力逐渐增强。茶多酚TP对照组对DPPH·的清除能力远远高于低聚木糖衍生物，浓度大于0.005 mg/mL茶多酚对DPPH·的清除能力几乎为100%。由于低聚木糖XO几乎对DPPH·无清除能力，而美拉德反应后的低聚木糖衍生物对DPPH·的清除能力显著提升，说明美拉德反应是赋予低聚木糖强抗氧化性的有效手段，这可能与美拉德反应过程中生成羰基类物质有关，相关机理有待进一步研究。

2.6 对O2-·的清除

O2-·是一类较毒的活性氧自由基，由多种生物反应和光化学反应产生，它还能分解形成更强的活性氧物质，如单线态氧和羟自由基，导致脂质过氧化［21］。图6描述了低聚木糖衍生物清除O2-·的能力，XP-30h、XP-15h、XP-5h对 O2-·半抑制浓度 IC50分别为0.581、0.618和1.199 mg/mL，即对 O2-·清除能力为:XP-30h＞XP-15h＞XP-5h，略低于茶多酚TP对照组(IC50为0.387m g/mL)，而远远高于低聚木糖(IC50为4.260 mg/mL)，这与上述DPPH·清除实验结果一致。

2.7 还原能力的测定

还原能力是表示抗氧化物质提供电子能力的重要指标，研究表明抗氧化活性和还原能力之间存在着密切的关系［22］。如图7所示，在浓度为0.5 mg/mL时，XP-30h、XP-15h和XP-5h的吸光度分别为1.205、1.198和0.994，还原能力强弱顺序为XP-30h≈XP-15h＞XP-5h;对照组茶多酚TP在浓度为0.5 mg/mL时的吸光度为1.496，高于低聚木糖衍生物。而低聚木糖几乎无还原能力，说明美拉德反应后的衍生物还原能力得到显著提升，这与上述DPPH清除实验和O2-·清除实验结果相一致。

3 结论

本实验以美拉德反应为改性手段，制备低聚木糖衍生物，并考察其对DPPH·和O-2·的清除能力，以及还原能力。结果表明，低聚木糖衍生物的抗氧化性均大大提升，故可以认为美拉德反应是低聚木糖改性的有效手段，且随着美拉德反应的进行，衍生物的抗氧化性越来越强，但相关机理还待进一步研究。本研究为运用天然多糖制备安全、高效的抗氧化剂提供了很好的思路。

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