菟丝子含药血清对TNF-α诱导下人蜕膜细胞凋亡的影响*

秦明春,贺 兰,张 吉,林 忠,李 利

(广西中医药大学附属瑞康医院妇科，广西 南宁 531000)

·实验研究·

菟丝子含药血清对TNF-α诱导下人蜕膜细胞凋亡的影响*

秦明春,贺 兰,张 吉,林 忠,李 利

(广西中医药大学附属瑞康医院妇科，广西 南宁 531000)

目的：通过菟丝子含药血清对肿瘤坏死因子-α(TNF-α)诱导人体外培养蜕膜细胞凋亡的影响，以期从蜕膜细胞凋亡角度探讨菟丝子可能的安胎机制。方法：体外培养人蜕膜细胞，通过TNF-α诱导蜕膜细胞凋亡，菟丝子含药血清干预，MTT比色实验分析TNF-α及菟丝子含药血清作用后人蜕膜细胞活力，并用流式细胞术分析菟丝子含药血清对人蜕膜细胞凋亡的影响。结果：TNF-α作用后的人蜕膜细胞活性均低于空白对照组，随着TNF-α质量分数的增加，活性越来越小；10，50μg/L的TNF-α作用后，与空白对照组对比，差别有统计学意义(P<0.05)。200mL/L菟丝子含药血清干预后的人蜕膜细胞活性高于TNF-α凋亡模型组，差别有统计学意义(P<0.05)。流式细胞术示菟丝子含药血清作用后的人蜕膜细胞凋亡率低于凋亡模型组，差别有统计学意义(P<0.05)。结论：TNF-α能降低体外培养人蜕膜细胞活力，诱导细胞凋亡；菟丝子含药血清对TNF-α诱导培养的人蜕膜细胞凋亡有一定抑制作用。

菟丝子；流式细胞术；细胞凋亡；人蜕膜细胞；安胎/药效学

细胞凋亡是细胞主动有序性的死亡。在妊娠过程中，早孕期人体蜕膜细胞的退化就是以凋亡的形式发生。随着妊娠的进展，蜕膜细胞的凋亡会明显减少，并与滋养细胞的侵入达到一种相对的稳定状态。在病理状态下,如感染引起的肿瘤坏死因子-α(TNF-α)增多等，这种稳态被打破，就可能会使凋亡细胞增加，影响胚胎发育，导致胚胎流产。菟丝子作为传统的“补肾安胎”圣药，其安胎作用已被长期的临床实践所证明。本研究采用TNF-α诱导人体外蜕膜细胞凋亡，通过菟丝子含药血清干预，观察菟丝子含药血清对蜕膜细胞异常凋亡的影响，以期从早孕蜕膜细胞凋亡角度研究探讨菟丝子保胎的作用机制。

1 材料与方法

1.1 标本来源

取自广西中医药大学附属瑞康医院妇科早孕人流手术室早孕40d左右健康孕妇人流蜕膜组织，并取得患者的知情同意。

1.2 药品、试剂与仪器

菟丝子含药血清，由广西中医药大学药学院药物制剂实验室制备，-20 ℃ 下无菌保存。DMEM/F12培养基(Hyclone公司产品，批号AQK29046)、类标准胎牛血清(Hyclone公司产品，批号20130105)、胰蛋白酶(Sigma公司产品，批号ZJ0451)，均购自上海拜力生物科技有限公司；胶原酶Ⅱ，Gibco公司产品，批号20100-17，购自上海艾研生物科技有限公司；TNF-α，Bioche产品，进口分装，批号M092904B，购自上海贝西科技发展有限公司；兔抗人Ⅷ因子相关抗原免疫组织化学检测试剂盒，批号50766924，购自北京中杉金桥生物技术有限公司；其他试剂均为国产分析纯。TECANSUNRISE型酶标分析仪，产地奥地利；流式细胞仪，美国Becton-Dickinson公司产品。

1.3 人体外蜕膜细胞的培养及鉴定

根据文献[1]加以改进，采用全组份蜕膜细胞的培养方式。无菌条件下取健康早孕40d左右人工流产蜕膜组织送至实验室；用冰D-hank’s液反复洗涮干净；于无菌玻璃皿中剪碎成糊状；用2倍体积的复合消化酶(2.5g/L胰蛋白酶，2g/L透明质酸酶和2g/L胶原酶按2∶1∶2比例混合而成)充分混匀后置于37 ℃，50mL/LCO2的培养箱中静置30min；用含200mL/L无菌胎牛血清的DMEM/F12培养液终止消化；收集消化后的上清液于无菌离心管中，1 000r/min离心 5min，收集细胞沉淀；同法再消化2次混合；用培养液重悬后计数细胞，以约5.0×105个/mL的量接种培养瓶中，置于37 ℃、50mL/LCO2的培养箱中培养；24h后换液，清除红细胞和未贴壁细胞；隔日换液，长满后传代。将培养3代细胞在载玻片上爬片，采用链霉素—生物素—过氧化物酶法(SABC)法进行细胞爬片的PRL免疫组化染色，操作严格按试剂盒说明书进行。

1.4 菟丝子含药血清的制备

将20只Wistar大鼠随机分为菟丝子组和空白组2组。制备质量分数为170g/L的菟丝子药液，给药剂量=临床常用量×动物等效面积系数×5，每100g体质量Wistar大鼠灌胃 2mL药液，空白组给予等量生理盐水灌胃，每日给药2次，连续1周。于最后一次给药1h后，无菌操作下采腹主动脉血；于4 ℃静置2h，用低温离心机 3 500r/min离心15min；收集血清；56 ℃恒温灭活 30min；用 0.22μm微孔滤膜过滤除菌；-20 ℃保存备用。

1.5 检测指标与方法

1.5.1 不同质量分数TNF-α对蜕膜细胞活力的影响

采用MTT比色实验。收集对数生长期细胞，计数按1×104个/孔接种于96孔板中，培养使其贴壁。TNF-α设质量分数为0.5，2.0，10.0，50.0μg/L4组，每组3孔，并设空白对照组。培养24h，加入MTT溶液(5g/L)孵育4h，终止培养，吸走培养液，每孔加入150μL的DMSO, 置于摇床上低速振荡约10min，待结晶溶解后用酶标仪于490nm处测量吸光值。细胞活力(%)=处理组OD值/空白对照OD值×100%。

1.5.2 200mL/L菟丝子含药血清对TNF-α诱导蜕膜细胞的细胞活力影响

采用MTT比色实验。收集对数生长期细胞，计数按1×104个/孔接种于96孔板中，培养使其贴壁。以1.5.1项下确定的质量分数为10μg/L的TNF-α造模，含药血清以预试验确定的 200mL/L菟丝子含药血清加入。设TNF-α凋亡模型组、TNF-α+200mL/L菟丝子含药血清组和空白对照组，每组3孔。培养 24h后同前加入MTT用酶标仪于490nm处测量各孔的吸光值，计算细胞活力。

1.5.3TNF-α+200mL/L菟丝子含药血清对蜕膜细胞凋亡的影响

采用流式细胞仪检测。收集对数期细胞，计数以2×105～5×105个/mL细胞接种在培养瓶内，培养使其贴壁。设TNF-α凋亡模型组、TNF-α+200mL/L菟丝子含药血清组和空白对照组共3组，每组2瓶。培养 24h后收集细胞，按1×106/mL调整细胞浓度于4 ℃预冷的700mL/L乙醇固定18h以上，取细胞悬液，用PBS洗3次，重悬于1mLPI染液中，37 ℃孵育30min进行流式分析。

1.6 统计学方法

2 结 果

2.1 人蜕膜细胞的形态学观察及鉴定

蜕膜细胞消化、接种后30min即开始贴壁，逐渐生长呈较长的梭形状和不规则星形；培养3～4d即可铺满瓶底，HE染色示：细胞核呈卵圆形，位于细胞中央，核仁清晰，有丰富的胞浆颗粒。PRL免疫组化染色鉴定见胞浆内细小棕色颗粒，越近细胞核，染色越强，计数结果显示 95%以上细胞PRL染色阳性，且细胞大小、形态均一。

2.2TNF-α对蜕膜细胞的细胞活力影响

以质量分数0.5，2.0，10.0，50.0μg/LTNF-α作用后的蜕膜细胞活力均低于空白对照组，并且随着TNF-α质量分数的增大，细胞活力变小。10μg/L和50μg/L组细胞活力与空白对照组对比，差别有统计学意义(P<0.05)，50μg/L时细胞大量死亡。见表1。

表1 各组蜕膜细胞的细胞活力检测

表1 各组蜕膜细胞的细胞活力检测

组 别细胞活力/%空白对照组80．45±12．320．5μg/LTNF⁃α组65．37±9．402．0μg/LTNF⁃α组50．45±7．3310．0μg/LTNF⁃α组38．34±5．54∗50．0μg/LTNF⁃α组11．08±3．21∗

注：与空白对照组对比，* P<0.05。

2.3 200mL/L菟丝子含药血清对TNF-α诱导蜕膜细胞的细胞活力影响

200mL/L菟丝子含药血清作用后的蜕膜细胞活力明显高于TNF-α凋亡模型组，差别有统计学意义(P<0.05)，但较空白对照组差别无统计学意义(P>0.05)。见表2。

表2 各组蜕膜细胞的细胞活力检测

表2 各组蜕膜细胞的细胞活力检测

组 别细胞活力/%空白对照组80．45±12．32TNF⁃α凋亡模型组38．34±5．54∗TNF⁃α+200mL/L菟丝子含药血清组68．22±8．54#

注：与空白对照组对比，* P<0.05；与TNF-α凋亡模型组对比，# P<0.05。

2.4TNF-α+200mL/L菟丝子含药血清对蜕膜细胞凋亡的影响

菟丝子含药血清作用后的蜕膜细胞凋亡率明显低于TNF-α凋亡模型组，差别有统计学意义(P<0.05)。见表3及图1。

表3 各组蜕膜细胞的细胞凋亡率检测

表3 各组蜕膜细胞的细胞凋亡率检测

组 别凋亡率/%空白对照组2．87±0．51TNF⁃α凋亡模型组11．72±2．05∗TNF⁃α+200mL/L菟丝子含药血清组4．03±0．80∗#

注：与空白对照组对比，* P<0.05；与TNF-α凋亡模型组对比，# P<0.05。

图1 各组蜕膜细胞凋亡流式散点图

3 讨 论

蜕膜是胚泡植入后子宫内膜间质高度分化而转化的结果，在雌、孕激素和溶解产物等的调控下生长分化构成胎盘的母面组织，与子面而来的滋养层共同构成了母胎界面[2]，对妊娠的继续和维持起到重要作用。有研究[3]表明：人早孕期蜕膜需要一定程度的退化，为滋养细胞的侵入提供空间。这种退化就是以凋亡的形式发生的，但蜕膜细胞的凋亡有一定的时空限制，若凋亡细胞增加或发生异常凋亡，就可能会影响妊娠的继续。人正常早孕约40d时，蜕膜细胞的凋亡与滋养细胞的侵入同步发生；早孕50d时，蜕膜组织的凋亡、重建和滋养细胞的侵入达到相对稳定状态[4]。若这一稳态打破，可能会导致细胞凋亡增加，胎盘发育受阻，妊娠终止。CinarO等[5]研究发现：复发性流产患者蜕膜细胞凋亡与正常妊娠蜕膜相比显著增加。李雪莲[6]等研究发现：早孕自然流产蜕膜中TNF-α的表达明显高于正常早妊组。早孕孕妇蜕膜组织中的TNF-α主要由激活的单核/巨噬细胞产生，体内适量的TNF-α对胚胎的生长发育可能是必需的，而病理状态下异常大量产生的TNF-α则会促使蜕膜细胞的过度凋亡及死亡，影响滋养细胞的侵入及胎盘的形成，影响胚胎发育。菟丝子为经典“补肾安胎”圣药之一，临床广泛使用，其安胎功效已被长期的临床实践所证实。药理研究表明：菟丝子黄酮为菟丝子的主要成分，具有雌激素样活性及抗氧化、清除自由基等多种生物活性[7]。有研究[8]显示：菟丝子黄酮可以增加雌激素受体和促黄体激素受体的表达。在本研究中，MTT比色实验提示TNF-α作用后的人体外培养蜕膜细胞活力明显降低，TNF-α量越大，活力越小；流式细胞术提示10μg/LTNF-α诱导培养的蜕膜细胞凋亡率明显高于空白对照组，差别有统计学意义(P<0.05)。此表明：TNF-α能明显抑制细胞增殖分裂的过程，降低细胞活力，诱导细胞凋亡。菟丝子含药血清干预TNF-α诱导蜕膜细胞后其凋亡率小于TNF-α组(P<0.05)，说明菟丝子含药血清对TNF-α诱导的蜕膜细胞凋亡有抑制作用。本研究初步表明：菟丝子在一定程度上能抑制早孕40d左右蜕膜细胞的异常凋亡。

妊娠是一个复杂的过程，蜕膜细胞的退化凋亡和滋养细胞侵入之间的平衡只是一个方面，并且这种平衡还受到诸多调控因子的调节。菟丝子补肾安胎作用除了抑制蜕膜细胞的异常凋亡外，有否从细胞因子的调控、免疫调节等其他方面来调节妊娠过程中的平衡状态从而达到保胎的作用，尚需进一步研究。

[1]刘小丽,秦明春,于爱敏,等.人蜕膜细胞体外培养体系的建立[J].实用预防医学,2007,14(5):1335-1336.

[2]李大金.母-胎界面免疫耐受微环境的分子信息传导机制[J].医学研究,2011,40(7):3-5.

[3]MendilciogluI，KaraveliS，ErdoganG，etal.ApoptosisandexpressionofBcl-2,Bax,p53,caspase-3,andFas,Fasligandinplacentascomplicatedbypreeclampsia[J].ClinExpObstetGynecol,2011,38(1):38-42.

[4]朱晓明,韩涛.母体蜕膜微环境与滋养细胞浸润[J].国际妇产科学杂志,2013,40(6):530-533.

[5]CinarO,KaraF,CanA.Potentialroleofdecidualapoptosisinthepathogenesisofmiscarriages[J].GynecolEndocrinol, 2012, 28(5):382-385.

[6]李雪莲，杜平，向亚莉，等.TNF-α在早期自然流产患者血清及蜕膜中的表达[J]. 中国优生与遗传杂志, 2011, 19(5):55-56.

[7]夏卉芳,李啸红.菟丝子的药理研究进展[J].现代医药卫生,2012,28(3):402-403.

[8]KeJ,DuanR.Effectsofflavonoidsfromsemencuscutaeonthehippocampal-hypothalamic-pituitary-ovariansexhormonereceptorsinfemaleratsexposedtopsychologicalstress[J].ClinExpObstetGynecol, 2013, 40(2):271-4.

(编辑 陶 珠)

1001-6910(2015)04-0065-03

R

B

10.3969/j.issn.1001-6910.2015.04.33

广西壮族自治区自然科学基金(2012jjBA40062)

2014-11-19；

2015-03-04