新加糖肾康对高糖环境下HK-2细胞外基质成分沉积的作用研究*

朱苗蕊，杨丽霞，薛建军，程 涛，田广芳，张定华，刘铜华

(1.兰州石化总医院，甘肃 兰州 730060； 2.甘肃省中医药研究院，甘肃 兰州 730050；3.甘肃省中医院，甘肃 兰州 730050； 4.北京中医药大学，北京 100029)

·实验研究·

新加糖肾康对高糖环境下HK-2细胞外基质成分沉积的作用研究*

朱苗蕊1，杨丽霞2，薛建军3，程 涛2，田广芳3，张定华3，刘铜华4

(1.兰州石化总医院，甘肃 兰州 730060； 2.甘肃省中医药研究院，甘肃 兰州 730050；3.甘肃省中医院，甘肃 兰州 730050； 4.北京中医药大学，北京 100029)

目的：通过观察新加糖肾康(简称TSK)对高糖诱导人肾小管上皮细胞(HK-2)的细胞外基质成分Ⅰ型胶原(ColⅠ)、Ⅲ型胶原(Col Ⅲ)和纤连蛋白(FN)的作用，探讨其在防治糖尿病肾间质纤维化方面的作用。方法：将体外培养的HK-2 细胞分为 6 组：空白对照组、高糖诱导组(30 mmol/L D-葡萄糖)、空白血清对照组(30 mmol/L D-葡萄糖+10%空白血清)、新加TSK低浓度组(30 mmol/L D-葡萄糖+5% 新加TSK药物血清)、新加TSK中浓度组(30 mmol/L D-葡萄糖+10% 新加TSK药物血清)、新加TSK高浓度组(30 mmol/L D-葡萄糖+20% 新加TSK药物血清)。药物干预后，ELISA法检测ColⅠ、Col Ⅲ和FN的含量。结果：高糖诱导后细胞外基质成分显著增加，与空白对照组相比有显著性差异(P<0.05)。但经新加TSK干预后其含量开始下降，与高糖诱导组相比有显著性差异(P>0.05)。结论：中药复方新加TSK能够抑制肾小管上皮细胞外基质成分的分泌，具有防治糖尿病肾间质纤维化的作用。

新加糖肾康/药效学；高糖/药物作用；人肾小管上皮细胞；细胞外基质成分；动物模型，大鼠

糖尿病肾病(diabetic nephropathy，DN)是糖尿病常见的慢性微血管并发症之一，其发病机制尚未明确。既往研究认为DN的早期病变在肾小球，近年来研究发现肾小管病变引起的间质纤维化与其关系更为密切，故肾间质纤维化的干预在DN的治疗中越来越受到重视[1]。肾间质纤维化的主要特征是细胞外基质成分沉积，因此抑制细胞外基质成分的分泌对肾间质纤维的治疗有重要意义。本课题所选中药复方糖肾康是甘肃省中医院刘国安教授和张定华主任医师在多年临床积累的基础上，经过反复的药物筛选，最终确立的临床经验方，具有益气养阴、清热祛湿、活血化瘀的功效。既往研究结果表明：糖肾康胶囊能够改善2型糖尿病患者血流动力学指标，减少尿微量白蛋白和24 h尿蛋白定量，对DN具有一定的治疗作用[2]。本课题在此研究基础上，结合北京中医药大学刘铜华教授治疗DN的学术思想[3]，对组方进行了优化，新增一味活血化瘀药水蛭组成新加糖肾康(简称TSK)，通过观察其干预高糖诱导体外培养人肾小管上皮细胞的细胞外基质成分的分泌，探讨其对DN肾间质纤维化的作用，为其临床应用提供科学依据。

1 材料与方法

1.1 细胞株

人肾小管上皮细胞株(HK-2)购于上海斯信生物科技有限公司。

1.2 动 物

雄性SPF级Wistar大鼠20只，体质量(200±20)g，购于甘肃中医学院动物中心，许可证号：SCXK(甘)2004-0006。大鼠饲养于甘肃省中医药研究院中药研究所动物室，普通饲料喂养。

1.3 药品、试剂与仪器

新加糖肾康由黄芪、生地黄、水蛭等组成，中药材由甘肃省中医院药剂科提供，用时水提醇沉。1640细胞培养基(批号1237579)、胎牛血清(批号12657-029),均为Gibco公司产品；人ColⅠ(批号E1378Hu)、Col Ⅲ(批号E1375Hu) 和FN ELISA试剂盒(批号E2002Hu)，均为上海晶天生物科技有限公司产品；D-葡萄糖，汕头西陇化工厂有限公司产品，批号0810142，根据文献配制为30 mmol/L的溶液[4]。 SANYO MCO-18AIC型CO2培养箱,产地日本；SW-CJ-2FD超净生物安全柜，产地中国；Olympus IX51型倒置显微镜,产地日本；Labsystems Multiskan MS 352型酶标仪，产地芬兰。

1.4 新加糖肾康药物血清制备

随机分为空白组、新加糖肾康组，每组10只。新加糖肾康组按成人临床用量的6.5倍灌胃，空白组灌服同体积生理盐水。每次10μL/g体质量，上、下午各1次，灌胃3 d。末次灌胃前8 h禁食、不禁水，灌胃30 min后大鼠股动脉采血，静置2 h后3 000 r/min冷冻离心20 min，取上清，-20 ℃保存，用时与培养基配成所需浓度。

1.5 细胞培养与分组

HK-2 细胞用含体积分数100 mL/L胎牛血清的1640培养基培养于 37 ℃、50 mL/L CO2细胞培养箱中。每隔 1～2 d换新鲜培养基1次，培养融合至 80 % 以上，用含 0.25 % 胰蛋白酶、0.05% EDTA 的消化液消化后，用新鲜培养基将细胞重悬后进行传代培养。实验前先用无血清培养基培养24 h使细胞同步化，实验重复3次。

细胞分为6组。①空白对照组：1640培养液；②高 糖诱导组：1640培养液+30 mmol/L D-葡萄糖；③空白血清对照组：1640培养液+30 mmol/L D-葡萄糖+10%空白血清；④新加糖肾康低浓度组：1640培养液+30 mol/L D-葡萄糖+5%TSK药物血清；⑤新加糖肾康中浓度组：1640培养液+30 mmol/L D-葡萄糖+10%TSK药物血清；⑥新加糖肾康高浓度组：1640培养液+30mmol/L D-葡萄糖+20%TSK药物血清。

1.6 检测指标

采用ELISA法检测ColⅠ、Col Ⅲ和FN的含量。细胞接种于24孔板，每孔1 mL，每组设2个复孔，培养过夜。按分组加入含相应浓度药品的培养液，每孔1 mL。分别于24 h、48 h收集细胞上清，4 ℃离心20 min(2 000 r/min),取上清，-20 ℃保存待测。指标检测按照ELISA试剂盒说明书进行。取出细胞上清，在试剂盒包被反应条每孔加入不同质量分数的标准品或待测标本，空白对照孔加稀释液100 μL，37 ℃孵育、洗涤、加酶标抗体和终止反应。在酶标仪上450 nm处，以空白对照孔调零，直接测定各孔OD值及样品浓度值。

1.7 统计学方法

2 结 果

ELISA实验结果显示：HK-2细胞经高糖诱导24 h、48 h后，ColⅠ、Col Ⅲ和FN的含量增加，与空白对照组对比，差别有统计学意义(P<0.05)；但经糖肾康药物血清干预后，其含量开始减少，特别是高浓度效果更为明显，与高糖诱导组对比，差别有统计学意义(P<0.05)，而空白血清没有类似作用。结果表明：糖肾康能够抑制高糖环境下人肾小管上皮细胞分泌细胞外基质成分，在一定程度上具有抑制糖尿病肾间质纤维化的作用。结果见表1～3。

表1 各组HK-2细胞ColⅠ含量对比

表1 各组HK-2细胞ColⅠ含量对比

组 别24h48h空白对照组0．553±0．085#0．520±0．071#高糖诱导组1．921±0．051∗2．187±0．107∗空白血清对照组0．580±0．106#0．459±0．061∗#新加糖肾康低浓度组1．617±0．118∗1．481±0．088∗#新加糖肾康中浓度组1．613±0．117∗1．597±0．039∗#新加糖肾康高浓度组1．606±0．123∗#1．342±0．148∗#

注：与空白对照组对比，*P<0.05；与高糖诱导组对比，#P<0.05。

表2 各组HK-2细胞Col Ⅲ含量对比

表2 各组HK-2细胞Col Ⅲ含量对比

组 别24h48h空白对照组2．544±0．251#2．131±0．112#高糖诱导组4．533±0．331∗6．026±0．216∗空白血清对照组2．611±0．370#2．289±0．386#新加糖肾康低浓度组4．407±0．295∗4．159±0．329∗△新加糖肾康中浓度组3．943±0．126∗#3．429±0．054∗#新加糖肾康高浓度组3．397±0．247∗#2．796±0．257∗#

注：与空白对照组对比，*P<0.05；与高糖诱导组对比，#P<0.05。

表3 各组HK-2细胞FN 含量对比

表3 各组HK-2细胞FN 含量对比

组 别24h48h空白对照组467．711±58．318△487．362±66．507△高糖诱导组1193．438±13．330∗1461．097±46．103∗空白血清对照组414．180±97．499#457．547±71．237#新加糖肾康低浓度组1231．385±61．166∗1050．461±63．972∗#新加糖肾康中浓度组1141．940±120．904∗1076．889±42．268∗#新加糖肾康高浓度组1095．184±78．950∗#1030．810±54．585∗#

注：与空白对照组对比，﹡P<0.05；与高糖诱导组对比，#P<0.05。

3 讨 论

糖尿病肾病是糖尿病的并发症之一。现代医学认为，糖尿病患者肾功能损害与肾小管间质病变的严重程度密切相关，其病理学特征为肾小管细胞外基质(extracellular matrixc，ECM)积聚、间质纤维化。研究发现：肾小管上皮细胞转分化为间充质细胞是肾间质纤维化发生机制之一，一般情况下炎症、损伤、细胞因子、高糖、终末糖基化产物均可诱导肾间质纤维化[5]。肾间质纤维化时ECM 主要由3 部分组成: ①胶原蛋白，包括Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ型胶原等； ②非胶原糖蛋白，包括纤连蛋白、层粘连蛋白、玻璃粘连蛋白、内皮粘连蛋白等; ③糖胺多糖与蛋白多糖，包括透明质酸、硫酸软骨素、硫酸角质素、肝素等[6]。本课题主要研究新加糖肾康对高糖诱导的肾间质纤维化ColⅠ、Col Ⅲ和FN的影响。

DN既属“消渴”，又属“肾病”范畴[3]。本病以消渴日久、缠绵不愈使脏腑功能失调，阴阳气血虚衰而发病。究其病因病机，历代医家多重视肾虚血瘀，基本病机特点为本虚标实。本虚指阴虚、阳虚、气虚、血虚、肝虚、心虚、脾虚、肺虚、肾虚；标实即痰浊、水湿、瘀血。本虚与标实互为因果，相互为病。如唐代孙思邈《千金要方》也认为消渴病的发病基础是“盛壮之时，不自慎惜，快情纵欲，极意房中，稍至年长，肾气虚竭，百病滋生”。《圣济总录》云：“消渴病久，肾气受伤，肾主水，肾气虚衰，气化失常，开阖不利，水液凝聚体内而出现水肿。”新加糖肾康组方符合DN本虚标实的理论基础，方中黄芪、生地黄益气养阴，为君药；槐米、大黄清热祛湿，为臣药；益母草、山楂、水蛭活血化瘀，为佐药。方中新增水蛭为虫类药，使组方的活血化瘀作用更强。

本研究结果显示：与空白对照组对比，人肾小管上皮细胞在高糖刺激后，细胞外基质成分ColⅠ、Col Ⅲ和FN的含量上升，差别有统计学意义(P<0.05)，说明高糖可以导致细胞外基质成分增多，是糖尿病肾间质纤维化的主要因素。以新加糖肾康干预后，ColⅠ、Col Ⅲ和FN的含量开始下降，与单纯高糖组对比，差别有统计学意义(P<0.05)，说明新加糖肾康在一定程度上能够抑制高糖刺激的细胞外基质成分沉积，具有抑制糖尿病肾间质纤维化的作用。

[1]李能娟，李红.肾小管上皮细胞表型转化与糖尿病肾病[J].国际内分泌代谢杂志，2006，26(4)：277-279.

[2]张东鹏，张定华，王晓晖.糖肾康胶囊对早期糖尿病肾病患者血浆内皮素-1、尿微量白蛋白的影响[J].中华实用中西医杂志，2010，23(3)：16-18.

[3]杨丽霞.刘铜华教授中医诊治糖尿病肾病的学术思想[J].国际中医中药杂志，2008，30(5)：385-386.

[4]凌光辉，唐文彬，孙林，等.Smad 锚着蛋白在高糖诱导人肾小管上皮细胞细胞外基质沉积中的作用[J].肾脏病与透析肾移植杂志, 2012,21(4):346-352.

[5]马强，陈俊香，程庆砾，等.阿魏酸钠对高糖诱导肾小管上皮细胞损伤的保护作用[J].华南国防医学杂志，2013,27(6)：379-382.

[6]俞东容. 中药抗肾间质纤维化机制研究[J]. 浙江中医药大学学报，2006，30(6)：694-695.

(编辑 陶 珠)

1001-6910(2015)03-0056-03

R285.5

B

10.3969/j.issn.1001-6910.2015.03.28

薛建军，副主任医师，1144870599@qq.com

甘肃省中医药管理局中医药科学技术研究课题(GZK-2011-13)；北京中医药大学创新团队项目(2011-CXTD-19)；国家自然科学基金面上项目(30973909)

2014-07-02；

2014-11-06