褪黑素对PANC-1细胞增殖的影响及机制探讨

谢俏，董丽凤，徐有青，崔培林

(1北京市垂杨柳医院，北京100022;2首都医科大学附属北京天坛医院)

胰腺恶性肿瘤对化疗及放疗的反应性差，因此 预后较差，为恶性程度较高的肿瘤之一。褪黑素是由松果体分泌的一种多功能的吲哚胺，近年多项研究证实其具有抑癌作用。Notch信号通路是一个高度保守的信号通路，Notch信号通路不仅可以决定细胞分化，而且在癌症的发生发展中起重要作用。2010年11月～2011年7月，我们观察了褪黑素对人胰腺癌细胞(PANC-1细胞)增殖的影响，并探讨其机制。

1 材料与方法

1.1 褪黑素、细胞及试剂 褪黑素;PANC-1细胞;高糖DMEM培养基，噻唑蓝(MTT)，95%乙醇，胎牛血清，γ内分泌酶抑制剂(DAPT)，DMSO，兔抗人NICD1，抗 β-actin 抗体，鼠抗兔 IgG，TRIzol，发光液。

1.2 PANC-1细胞分组及褪黑素干预 取PANC-1细胞，加入含10%胎牛血清的DMEM培养基，置于37℃、5%CO2饱和湿度的细胞培养箱中培养。将细胞分为以下几组:①对照1组:取对数生长期的PANC-1细胞，用不含胎牛血清的DMEM培养基饥饿24 h后，吸弃培养液，用含10%胎牛血清的完全培养基培养24 h。②褪黑素处理组:取对数生长期的PANC-1细胞，用不含胎牛血清的DMEM培养基饥饿24 h后，将PANC-1细胞的完全培养基中分别加入浓度为1 000 000、1 000、1 nmol/L的褪黑素(用95%的乙醇稀释褪黑素)，培养24 h。取以上2组处理细胞进行细胞增殖率和Notch活性片段NICD1表达的检测。③对照2组:取对数生长期的PANC-1细胞，用不含胎牛血清的DMEM培养基饥饿24 h后，吸弃培养液，用含10%胎牛血清的完全培养基培养24 h。④DAPT组:选取对数生长期的PANC-1细胞，用不含胎牛血清的DMEM培养基饥饿24 h后，在 PANC-1细胞完全培养基中加10 μmol/L DAPT，培养24 h。

1.3 PANC-1细胞增殖率计算 取约3×104个细胞，接种于96孔板中，细胞贴壁后取于对数生长期时，将细胞分成对照1组、褪黑素组和对照2组、DAPT组，按照分组情况在培养基中加褪黑素、DAPT培养24 h，吸弃培养基，每孔加MTT(5.0 g/L)20 μL，继续培养4 h，吸弃上清，每孔加入 DMSO 150 μL，避光振荡15 min，应用全自动酶标仪检测490 nm处各孔的吸光度值(A值)，实验重复3次，通过公式计算细胞增殖率，即细胞增殖率=A对照组/A实验组×100%。

1.4 PANC-1细胞NICD1蛋白检测 采用Western blotting法。将细胞分成对照1组、褪黑素组和对照2组、DAPT组，按分组情况处理后取约2.6×107个细胞，悬于细胞裂解液中冰浴30 min，裂解细胞，以12 000 r/min离心15 min，提取蛋白质，定量后取90 μg蛋白与5×加样缓冲液混匀，100℃变性5 min，冷却后上样。恒压电泳2 h，4℃下将样品转移到PVDF膜上，TBST洗涤3次，5 min/次。加入兔抗人NICD1(1∶1 000)，4 ℃过夜，TBST洗涤3次，5 min/次。加入抗兔二抗(1∶3 000)，室温振荡孵育2 h，TBST 洗涤3 次，5 min/次。加入化学发光液，暗室中显影2 min，TBST洗涤，晾干。以β-actin作为内参照。

1.5 统计学方法 采用SPSS16.0统计软件。计量资料以±s表示，组间比较采用单因素方差分析。P≤0.05为差异有统计学意义。

2 结果

对照1组细胞增殖率为0.38% ±0.03%，褪黑素组加入1、1 000、1 000 000 nmol/L的褪黑素后细胞增殖率分别为 0.36% ± 0.02%、0.32% ±0.02%、0.26% ±0.01%，对照1 组与褪黑素组加入1 000、1 000 000 nmol/L的褪黑素后增殖率比较，P均 ＜0.05。对照 2组细胞增殖率为 0.43% ±0.02%，DAPT 组细胞增殖率为 0.30% ±0.02%，两组比较，P＜0.05。对照1组NICD1相对表达量为0.47 ± 0.05，褪黑素组加入 1、1 000、1 000 000 nmol/L的褪黑素后NICD1相对表达量分别为0.32±0.04、0.33 ±0.05、0.21 ±0.03，对照 1 组与褪黑素组加入1 000 000 nmol/L的褪黑素后NICD1相对表达量比较，P均＜0.05。对照2组NICD1相对表达量为0.63±0.05，DAPT组 NICD1相对表达量为0.38 ±0.03，两组比较，P ＜0.05。

3 讨论

胰腺癌是一种恶性程度高、诊断和治疗困难的消化道恶性肿瘤，约90%为起源于腺管上皮的导管腺癌，其发病率和病死率高。胰腺癌5年生存率不足1%，是预后最差的恶性肿瘤之一。PANC-1细胞是从人胰腺癌中分离出来的肿瘤细胞，本实验中用PANC-1细胞模拟胰腺癌的体外模型。

褪黑素是人体内重要的抗肿瘤天然屏障，很多肿瘤的发生发展均与褪黑素相关。大量研究表明，褪黑素的抗肿瘤活性可能与其免疫调节、抗增殖、抗氧化和抗血管新生机制相关。目前已有研究［1，2］表明，褪黑素的生物学机制可能与肿瘤进展相关，但是没有直接数据表明褪黑素对胰腺癌细胞有增殖抑制作用。我们前期的研究表明，褪黑素可以抑制不同肿瘤的生长，促进肿瘤化疗方案的发展。研究［3］证实，Notch信号通路参与胰腺肿瘤的发生发展。由此我们假设褪黑素与Notch信号通路的相关性。

高浓度的褪黑素可以抑制PANC-1细胞的增殖，但低浓度(几乎为生理浓度)的褪黑素不能明显抑制细胞的增殖。本实验结果与我们前期的实验结果一致。我们前期研究［4］发现，褪黑素对人类脐静脉内皮细胞的抗增殖作用可能有两种机制，一种是阻断细胞循环，另外一种是诱导细胞凋亡。褪黑素(生理水平的10倍以上)可以阻断PANC-1细胞进入有丝分裂的S期，因此减少细胞数，抑制细胞增殖。褪黑素从以下三个方面参与细胞凋亡过程:①褪黑素抑制免疫细胞的凋亡;②褪黑素阻断神经细胞凋亡;③褪黑素增加肿瘤细胞的凋亡率。这些研究结果均提示褪黑素的作用可能与细胞的类型、不同功能状态下的细胞或其他因素如药物浓度有关［5，6］。本实验表明，褪黑素的作用剂量为关键因素，结合前期实验，提示褪黑素的作用剂量和作用时间对其效应有决定性意义。同样作用24 h，高浓度的褪黑素可以导致PANC-1细胞凋亡增加，但是接近生理浓度(1 nmol/L)的褪黑素却不能有上述作用。

Notch信号通路在胰腺癌细胞的增殖以及凋亡中起重要作用［7］。γ内分泌酶切割跨膜蛋白从而激活Notch信号通路，释放的细胞内部分向细胞核迁移，与转录因子结合，从而导致许多基因的表达［8］。DAPT可以抑制Notch信号通路的激活，还可以抑制细胞增殖，从而导致癌症细胞的凋亡。用siRNA下调Notch1的表达可以抑制细胞的增殖，从而导致体外胰腺癌细胞凋亡［9，10］。本实验中用 DAPT处理PANC-1细胞后，增殖率明显下降。由此我们推断，抑制Notch信号通路可以抑制胰腺癌细胞的增殖，即Notch通路可以促进胰腺癌细胞增殖。高浓度褪黑素可以抑制胰腺癌细胞的增殖，Notch通路的抑制剂DAPT同样可以抑制胰腺癌细胞的增殖。我们猜测高浓度的褪黑素可以通过Notch信号通路影响胰腺癌细胞的增殖。

我们在PANC-1细胞中检测到NICD1的表达，这表明Notch信号通路在胰腺癌细胞中是处于持续激活状态的。这与近年来的研究提示Notch信号通路在胰腺癌中高表达一致［11～15］。在 PANC-1细胞中检测到Notch1的活性片段也证实了Notch信号通路作为促癌基因在胰腺癌进展中起关键作用。本实验选取不同浓度的褪黑素对胰腺癌细胞作用24 h后，检测NICD1的表达情况提示，生理浓度(低浓度)的褪黑素可以抑制NICD1的表达，这可以解释正常生理条件下不会患胰腺癌。由此推测胰腺癌的发生在某种程度上可能与褪黑素浓度下降相关。褪黑素生理节奏紊乱即分泌高峰延迟，可能会导致包括胰腺癌在内的上消化道系统肿瘤的发生［16］。高浓度的褪黑素可以显著下调NICD1的表达，高浓度的褪黑素同样可以显著抑制PANC-1细胞的增殖，由此我们推断，褪黑素通过抑制Notch通路进而抑制胰腺癌细胞的增殖。

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