简述猪蓝耳病（PRRS）的诊断技术

黎先伟 译

迄今为止，无论花费了多大的成本和努力，我们仍没有建立一套有效的预防、控制和清除猪繁殖与呼吸综合征（蓝耳病，PRRS）的策略。不过，对我们兽医工作者来说，掌握最佳的诊断方法来准确的提前预判猪场蓝耳病稳定与否是非常重要的。目前，有什么工具和/或手段来协助我们呢？下面我们将一一阐述。

猪繁殖与呼吸综合征是一种病毒性、灾难性的传染病。其临床表现为母猪严重的繁殖障碍、断奶仔猪普遍发生肺炎、生长迟缓以及死亡率增加等症状。猪蓝耳病是一个全球性的问题，对世界养猪业和经济造成非常重要的影响。单单在美国，每年由于猪蓝耳病对养猪业所造成的损失估计可达到6.64亿美元。

为了应对这些挑战，研发和实施一种可靠的、准确的和及时的诊断措施是有效防控猪蓝耳病的一个重要组成部分。随着诊断技术的日益发展，对于兽医和养猪业的利益相关者来说，继续采取最佳的措施以协调应对疾病的发展，从而保持整个行业的稳定是非常重要的。

一、选择合适的诊断方法

选择一种合适的猪蓝耳病诊断方法最为关键的第一步是，确定实施检测的目标。这些目标可能包括在一个群体中检测出至少一头受感染的动物；判断病毒在群体中的流行情况；确定分离的是野毒还是疫苗毒，或评估感染的时间。这些因素将取决于待检测的动物、需求样品的数量以及合适组织的使用。此外，个别动物的检测结果可能不能很好的反应整个群体的状态，因为每个动物感染的状态都有所差异，所以我们在分析结果时必须多加注意。

二、选择合适的样本数

当选择合适的用于诊断猪蓝耳病的样本数时，需要考虑到多种因素。为了从一个群体中鉴定出至少一份阳性样本，需要考虑的因素包括群体大小、群体内疾病的预期流行率、所需确定性的程度，以及所采用的检测方法的敏感性和特异性。

检测的时机也是非常重要的，因为感染和免疫反应的多种方面，包括病毒血症、病毒释放、抗体应答和特征性病变仅会在特定的时间内出现。

三、选择合适的组织样本

一般来说，诊断检测大体分为两类：病毒（抗原）检测和病毒抗体检测。病毒（抗原）检测需要采集富含病毒的组织、支气管肺泡灌洗液（BALF）、胸腔液、精液、血液、唾液或环境样本；而病毒抗体检测则需要采集血液（血清）、唾液或肌肉渗出液等，以检测抗蓝耳病抗体的水平。因此，组织样本的选择取决于多种不同的因素，包括特定的检测目的、所选择的诊断方法和可用的设备。

四、诊断方法

自从发现猪蓝耳病以来，人们已采用过各种不同的技术和/或方法来检测猪蓝耳病病毒（PRRSv）及其抗体，目前其中一些诊断技术和/或方法很少用于临床诊断，这有多方面的原因：首先可能是这种方法更适用于实验室；第二该方法需要耗费过长的时间；第三成本昂贵或需要专业培训过的人员等等。在下本中，我们将简要描述现在针对猪蓝耳病主要采用的检测技术，同时谈及一些较为传统的方法以阐明近几年来诊断技术和/或方法已发展到什么程度。

五、猪蓝耳病病毒（PRRSv）的检测

病毒的检测技术可对疾病感染的状态作出一个很好的指示，不过这些技术和/方法往往主要作为实验室研究的工具，因为它们的操作需要经过专业培训的实验人员、而且成本较高以及所需的时间较长。一旦从样本中分离到病毒，可使用特定的细胞系通过一系列的感染和复制从组织样本中扩增病毒。另一种方法就是采用电子显微镜直接观察病毒，不需要通过特定分子或抗体来识别病毒，这在描绘新病毒株方面具有重要的作用。目前，新型、快速和低成本的诊断技术（见下文描述）已被广泛使用，这些技术对于常规和快速诊断具有更高的实用性和便捷性。

1.反转录-聚合酶链反应（RT-PCR）。当怀疑病毒具有垂直传播的特性时，可选择胎儿样本进行反转录-聚合酶链反应。该方法可用于快速的、特异的和高度敏感的从不同的组织（包括血清、精液、唾液、肺组织、淋巴结、脾脏和扁桃体）和环境样本中检测猪蓝耳病病毒。这个方法的主要步骤包括从组织样本中抽提病毒RNA；RNA通过逆转录为DNA；DNA的PCR扩增以及扩增DNA的检测。

反转录-聚合酶链反应的缺点是组织样本之间和动物之间感染后病毒的检测会有差异。此外，RTPCR的高度敏感性可能会由于样本受污染而出现假阳性，而特定的引物对一些容易变异的病毒往往容易出现假阴性的结果。

2.免疫组化（IHC）。免疫组化方法可用于从不同部位的组织（包括肺脏、淋巴结、胸腺、扁桃体、脾脏和肾脏）中检测猪蓝耳病病毒。简单来说，先用福尔马林固定组织样本，随后用针对病毒核衣壳的单克隆抗体进行标记。最后采用一种经标记的第二抗体通过显微镜直接观察组织中是否存在病毒。虽然免疫组化具有高度的特异性（100%），但是其仅有中等的敏感性（67%）。不过，在固定的48h内处理组织可有效改善免疫组化的敏感性。在感染早期，敏感性的程度是最高的；而在感染后期阶段，敏感性的程度会逐渐下降，如感染后超过28d，更不用说感染后超过90d。虽然免疫组化可有效鉴别仔猪中垂直传播的病毒，但是对于一些容易变异的病毒，这种方法往往难以达到理想的效果。

3.荧光抗体染色法（FA）。荧光抗体染色法，通常用于评估支气管肺泡灌洗液（BALF）或新鲜/冰冻的肺组织的病毒感染情况，不过目前该方法临床上较少使用。在该技术中，样本直接用荧光抗体进行标记来观察病毒粒子。对于检测猪蓝耳病病毒来说，这种方法要比免疫组化法更为快捷和便宜，但是与免疫组化相比，荧光抗体染色法不能检测病毒株的遗传多样性，而且不推荐在感染后期使用这种方法。此外，荧光抗体染色可能也存在假阳性的问题，这可能是由于原始抗体或高背景染色的特异性较差所造成的。

4.临床试纸条检测。试纸条检测在猪蓝耳病病毒的诊断中是一种比较新的技术，尽管尚未得到广泛的应用，但是这种方法可快速、便捷的检测出猪蓝耳病病毒，而不需要专业的知识或设备。试纸条通过免疫层析法检测血清或组织匀浆中的病毒。简单来说，这种方法的原理是样本中的病毒与针对猪蓝耳病病毒特定蛋白的金标单克隆抗体相混合，形成蛋白-抗体复合物聚集在试纸条内。随后用一种经标记的第二抗体检测聚集的蛋白-抗体复合物。目前，这种方法暂时只适用于有限的病毒。

六、猪蓝耳病病毒特异性抗体的检测

血清中猪蓝耳病病毒特异性抗体的检测是诊断猪蓝耳病最为常用的方法，此外，也可以用唾液样本或肌肉渗出液来进行检测。在美国，自从2010年以来，采用唾液样本来诊断猪蓝耳病的比例大幅增加。

猪蓝耳病病毒抗体的检测是一个不断发展的诊断学科。一些方法和/或技术与时间和资源问题有关，目前主要用于实验室研究。这些方法和/或技术包括免疫过氧化物酶单层细胞试验法（IPMA），一种高度特异且敏感的方法，而且是首次报道用于猪蓝耳病诊断的血清学方法。在这个试验中，经过氧化物酶标记的第二抗体检测的受病毒感染的细胞中的抗猪蓝耳病病毒抗体富集于微孔板内。随后通过光学显微镜来评估阳性样本。同样，病毒中和（VN）会产生难以解释的结果。

虽然抗体检测可鉴定出新的猪蓝耳病病毒感染，但是这不适于监测以往受过感染的群体，因为这种方法无法区别这些是新感染、旧感染还是接种疫苗所产生的抗体。

1.酶联免疫吸附试验。酶联免疫吸附试验是检测猪蓝耳病病毒抗体中最为常用的一种方法。2010年爱荷华州立大学的研究已证实，酶联免疫吸附试验的特异性可高达99.9%，敏感性也能达到98.8%。微孔表面覆盖大量的猪蓝耳病病毒融合（N）蛋白用来捕获组织样本中的抗猪蓝耳病病毒抗体，随后用过氧化物酶标记的抗体显示捕获的抗猪蓝耳病病毒。

虽然酶联免疫吸附试验既快捷又方便，但这种方法也有其局限性。免疫反应在动物和检测抗体的水平之间通常是可变的，这不一定能反映病毒的毒力。此外，母源抗体和饲料中的抗体可能也会影响最终的结果。早期感染期间的可能会出现假阴性也是需要关注的一个问题。

2.荧光微球免疫分析法（FMIA）。荧光微球免疫分析法是一种多重版的酶联免疫吸附试验，即采用不同的染色荧光微球来捕获多种抗猪蓝耳病病毒抗体，随后用荧光标记的第二抗体进行标记。这种技术可在单一的小样本中同时检测几种不同的抗体。研究结果证实，荧光微球免疫分析法对血清样本的敏感性和特异性分别可达到98%和95%。此外，众所周知传统的方法用于检测唾液样本的敏感性较低，但采用FMIA的敏感性和特异性则分别可达到92%和95%。而且对于早期感染的检测，FMIA要比ELISA具有更高的敏感性。

3.间接免疫荧光试验（IFA）。

间接免疫荧光试验与免疫过氧化物酶单层细胞试验法相似，不同的是使用荧光标记的第二抗体来检测捕获的抗猪蓝耳病病毒抗体。研究已表明，间接免疫荧光试验具有较高的特异性，而敏感性则取决于多种不同的因素，包括用于捕获抗体的细胞类型、实验室条件和抗猪蓝耳病病毒的抗原性。通常情况下，样本进行ELISA检测之后再进行间接免疫荧光试验以排除假阳性的结果。此外，这种方法也可采用唾液和肌肉渗出液样本来进行试验。

4.临床试纸条检测。试纸条检测技术除了可用于检测病毒抗原以外，现在这种方法也可用于检测猪蓝耳病病毒抗体（采用病毒融合蛋白）。胶体金试纸条技术不仅低成本、快捷和方便使用，而且不需要昂贵的设备和专业技术人员。据报告，这种方法的敏感性和特异性分别可达到93%和98%。不过，这种方法还没有被广泛使用。

七、病毒分离株的特性

病毒分离株的特性对于管理者及时做出正确的决策来说往往是非常重要的，如决定是否需要把养殖场内的动物转移到另一个区域、跟踪病毒的蔓延趋势以及确定是否新的病毒株存在于猪群内。分子生物学技术，包括RFLP和DNA序列分析要比传统方法更准确的分析猪蓝耳病病毒的特异性。

八、序列分析

目前，病毒基因组的序列分析是鉴定猪蓝耳病病毒最常选择的方法。从血清和受感染组织的样本中提取的PCR产物进行基因测序和系统进化树分析，这可为病毒株的分析提供最可靠的数据。ORF5序列的高变区用于区分病毒株是最为可靠的，而且ORF5的全基因序列也常用于分析比对不同的病毒。不同病毒株之间的遗传进化关系可通过绘制系统进化树来表示。这可有效反应养殖场群体的感染水平，以监测当地群体内病毒株的变异情况。当在群体内发现潜在的新变异病毒时必须引起高度重视。

九、猪蓝耳病病毒（PRRSv）诊断的未来

要想成功的从猪群中控制和清除猪蓝耳病病毒的感染，我们需要采用常规监测和疾病诊断相结合的方法。虽然一系列的诊断技术已有效地成为诊断猪蓝耳病病毒的手段，但是对于所有的情况和动物，目前仍没有一种检测技术是100%可靠的。随着新技术的不断引入，人们日益要求确保在合适的时间点对合适的动物进行合适的检测，并采用合理的干预来优化有效的管理措施，从而最大化的预防或控制疾病的暴发。（By Olivier Duran）