宫颈鳞状细胞癌组织中肿瘤浸润淋巴细胞计数变化及意义

单莉，郝春妮(烟台山医院，山东烟台264001)

宫颈鳞状细胞癌组织中肿瘤浸润淋巴细胞计数变化及意义

单莉，郝春妮
(烟台山医院，山东烟台264001)

摘要:目的观察宫颈鳞状细胞癌组织中肿瘤浸润淋巴细胞的表达变化，并探讨其意义。方法108例宫颈鳞状细胞癌患者，手术切除肿瘤组织，免疫组化学染色观察宫颈鳞状细胞癌组织中、Foxp3+、GranzymeB+、细胞的分布，同时对其进行计数。分析其与患者临床病理参数和预后的关系。结果宫颈鳞状细胞癌患者Foxp3+细胞数量癌内大于癌周、细胞数量癌周大于癌内(P均＜0.05)。宫颈鳞状细胞癌组织中细胞数量与临床分期有关，Foxp3+细胞数量与病理分级有关和Foxp3+细胞数量与淋巴转移有关(P均＜0.05)。宫颈鳞状细胞癌组织Foxp3+细胞与患者无瘤生存时间呈负相关(HR: 2.217，95%CI: 1.843～2.671，P=0.012)，与总生存时间呈负相关(HR: 2.451，95% CI: 1.992 ～2.734，P=0.033)。结论宫颈鳞状细胞癌组织内、细胞数量增多，Foxp3+细胞数量减少。Foxp3+细胞是宫颈鳞状细胞癌术后的独立预后因素。

关键词:宫颈肿瘤;宫颈鳞状细胞癌;免疫微环境;免疫逃逸;肿瘤浸润淋巴细胞

宫颈鳞状细胞癌是常见的妇科恶性肿瘤之一，严重威胁妇女的健康和生命。关于宫颈鳞状细胞癌的预后因素研究一直聚焦于肿瘤细胞本身，较少研究与肿瘤局部免疫微环境指标的关系。肿瘤浸润淋巴细胞是存在于肿瘤间质内以T细胞为主的一种异质性淋巴细胞群体，是机体淋巴细胞浸入到肿瘤组织内部对肿瘤的抵抗现象，它们的抗肿瘤免疫效应主要是细胞免疫反应［1，2］。本研究主要的肿瘤浸润淋巴细胞的亚型有、Foxp3+细胞，暂未列入细胞［3，4］。本研究观察了宫颈鳞状细胞癌组织中肿瘤浸润淋巴细胞的表达变化，并探讨其意义。

1　资料与方法

1.1临床资料选取2010年1月～2014年12月在烟台山医院住院手术的宫颈鳞状细胞癌患者108例，年龄35～72(45.3±9.6)岁，均有完整的临床病理资料。依据国际妇产科联盟(FIGO，2000年)修订的临床分期标准，Ⅰ期42例、Ⅱ期31例、Ⅲ期35 例;病理分级: G1级30例、G2级43例、G3级35例;有淋巴结转移41例。患者均行手术完整切除肿瘤，组织学检查切缘阴性。排除标准:曾接受过放化疗及免疫治疗;合并免疫系统疾病;合并慢性消耗性疾病及传染病;合并有其他类型恶性肿瘤。

1.2肿瘤浸润淋巴细胞检测及其与宫颈鳞状细胞癌患者预后的关系分析方法采用免疫组化法检测108例宫颈鳞状细胞癌患者肿瘤组织中NK细胞、Foxp3+调节性T细胞(Treg)、GranzymeB+活化的细胞毒性淋巴细胞、CD45RO+记忆T细胞、细胞毒T细胞的数量。用不同的单克隆抗体［鼠抗人CD45RO、鼠抗人CD57、兔抗人CD8、鼠抗人GranzymeB购自Maixin-Bio(迈新生物)，Foxp3+抗体购自BioLegend(USA)］对上述细胞行免疫组化染色。二抗为Leica-二抗套装试剂。采用Leica公司的全自动免疫组化染色一体机，所有步骤由Bond-Max自动完成。在400倍高倍显微镜下观察阳性细胞(细胞膜或细胞核呈棕色或棕黑色颗粒者判定为阳性细胞)。采用电脑图像采集系统随机选取5个高倍视野拍照，再用图像分析软件(NIH Image 1.46 bundled with 64-bit Java)计算总阳性细胞数。由2位高年资病理科医师读片，采取双盲交叉读片，取平均值。患者临床病理资料包括年龄、临床分期、淋巴结转移情况、肿瘤分化程度、术后复发转移情况等。生存期从手术当天计算，终止日期为死亡日期或末次随访日，所有病例截止日期为2014年6月31日。对可疑复发者进行强化CT和(或) MR扫描来确诊复发/转移。分析上述免疫细胞与患者临床病理参数和预后的关系。

1.3统计学方法采用SPSS12.0统计软件。计量资料以珋x±s表示，多组间比较采用one-way ANOVA，两组间比较用t检验;计数资料比较用χ2检验或Fisher精确检验;相关分析采用Spearman相关;累积生存时间和累积生存率计算采用Kaplan-Meier法，生存检验采用Log-rank检验;用Cox回归模型作单因素和多因素与预后关系的分析。P＜0.05为差异有统计学意义。

2　结果

2.1宫颈鳞状细胞癌组织中肿瘤浸润淋巴细胞的分布、数量除Foxp3+阳性染色细胞为细胞核棕色着色外，其余细胞均呈细胞质和(或)细胞膜棕色染色。细胞呈圆形或椭圆形，散在分布于肿瘤细胞和周围间质中，没有明显的密集趋势。GranzymeB+阳性染色呈颗粒状的细胞质着色，细胞无密集趋势，均散在分布于癌组织、周围增生的纤维组织中，棕色阳性颗粒可环绕细胞呈圆形或半圆形。CD45RO+阳性细胞呈细胞质或细胞膜棕褐色，细胞体积较小，大部分弥散性分布。细胞为细胞膜和细胞质呈棕黄色染色的小圆细胞。宫颈鳞状细胞癌患者癌内、癌旁组织中细胞分别为30.15±细胞分别为340.53±50.11、430.29±38.74，GranzymeB+细胞分别为29.03±1.53、40.37±3.42细胞分别为128.71 ±22.73、240.38±37.97，Foxp3+细胞分别为31.03 ±2.41、19.32±3.56，两者比较，P均＜0.05。

2.2宫颈鳞状细胞癌组织中肿瘤浸润淋巴细胞与患者临床病理参数的关系宫颈鳞状细胞癌组织中细胞数量与患者临床分期有关(P均＜0.05)，肿瘤临床分期越高细胞局部浸润越少。宫颈鳞状细胞癌组织中Foxp3+和细胞数量与患者病理分级有关(P均＜0.05)，肿瘤分化越差患者Foxp3+细胞越多，肿瘤分化越好患者细胞越多。宫颈鳞状细胞癌组织中细胞数量与患者淋巴转移有关(P均＜0.05)，有淋巴转移的患者Foxp3+细胞越多，无淋巴转移的细胞越多。详见表1。

表1　宫颈鳞状细胞癌组织中浸润淋巴细胞数量与患者临床病理参数的关系(个，±s)

临床病理参数　n　CD+57　CD45RO+　GranzymeB+　CD+8　Foxp3+年龄≤40岁　35　29.65±2.56　346.78±98.54　28.43±6.21　126.65±23.97　30.23±4.56 ＞40岁　73　30.42±6.16　334.53±65.11　29.85±3.47　130.91±31.17　31.77±7.23临床分期Ⅰ42　28.32±3.61　394.28±64.14　29.72±5.33　149.83±25.14　28.41±4.34 Ⅱ31　31.77±2.79　336.43±23.77　28.63±2.37　124.74±35.36　30.28±5.16 Ⅲ35　29.32±1.57　287.24±71.35　29.09±3.24　96.23±13.42　30.13±3.75病理分级G1　30　27.57±9.47　380.79±31.11　30.41±2.31　121.37±13.41　36.24±5.6 G2　43　29.91±3.04　326.88±26.12　29.04±4.27　128.43±13.54　30.27±1.02 G3　35　28.97±1.45　286.27±24.41　28.78±3.44　128.17±12.87　25.97±3.47淋巴转移有41　31.22±3.82　328.59±79.31　27.13±1.25　106.43±18.64　39.27±3.86 无67　28.89±2.63　357.64±81.35　29.23±3.51　147.59±18.17　22.23±4.76

2.3宫颈鳞状细胞癌组织中肿瘤浸润淋巴细胞与患者预后的关系108例患者整体的5年无瘤生存率分别为53.70%，总生存率为47.22%。中位随访时间为28个月(3～80个月)。主要死于肿瘤复发转移。使用X-tile软件计算出的最小P值作为cutoff值将各肿瘤浸润淋巴细胞分成高浸润组、低浸润组。CD5+7细胞cut-off值为29.36，高浸润组45例、低浸润组63例; CD45RO+细胞cut-off值为310.58，高浸润组68例、低浸润组40例; CD8+细胞cut-off值为115.71，高浸润组60例、低浸润组48例; GranzymeB+细胞cut-off值为28.47，高浸润组57例、低浸润组51例; Foxp3+细胞cut-off值为27.17，高浸润组49例、低浸润组59例。COX单因素生存分析显示，患者无瘤生存时间(DFS)与宫颈鳞状细胞癌组织CD8+细胞(HR: 0.997，95% CI: 0.684～1.314，P=0.028)呈正相关、Foxp3+细胞(HR: 2.217，95%CI: 1.843～2.671，P=0.012)呈负相关;患者总生存时间(OS)与宫颈鳞状细胞癌组织CD8+细胞(HR: 1.057，95%CI: 0.792～1.372，P=0.046)呈正相关、Foxp3+细胞(HR: 2.451，95% CI: 1.992～2.734，P=0.033)呈负相关;患者DFS、OS与癌组织CD5+7、CD45RO+、GranzymeB+细胞无关。COX多因素生存分析显示，宫颈鳞状细胞癌组织Foxp3+细胞与患者DFS呈负相关(HR: 2.217，95% CI: 1.843～2.671，P=0.012)，与OS呈负相关(HR: 2.451，95%CI: 1.992～2.734，P=0.033)。

3　讨论

作为肿瘤与机体作用的主要部位，肿瘤局部免疫反应在一定程度上反映了机体抗肿瘤免疫的总体水平。肿瘤局部的免疫以特异性的细胞免疫为主导，其效应细胞为细胞毒性T淋巴细胞和NK细胞。NK细胞具有无需抗原刺激即能杀伤肿瘤细胞的能力。细胞毒性T淋巴细胞被一致认为是最主要的免疫效应细胞［1，5］。活化的细胞毒性T细胞以GranzymeB+为标志物。抗原特异性记忆T淋巴细胞可以在特定细胞因子的作用下分化为效应T淋巴细胞，也可以像干细胞一样自我更新、继续分化为记忆/效应细胞，因此记忆T细胞可以作为T细胞活化标志［3，4］。Foxp3+Treg具有免疫无能性和免疫抑制性两大功能。以上细胞均在局部免疫微环境中发挥着免疫监视、免疫效应、杀伤肿瘤细胞的作用［6，7］。

本研究发现宫颈鳞状细胞癌周围的、细胞数量明显多于癌内部，这表明机体在肿瘤周围的免疫反应明显强于肿瘤内部。进一步分析发现，宫颈鳞状细胞癌的临床分期越晚，细胞局部浸润越少;肿瘤分化越差，CD45RO+细胞越少，这说明随着病情进展，肿瘤晚期内部微环境的免疫抑制状态越来越严重。同时，细胞在有淋巴转移的宫颈鳞状细胞癌中数量少于无淋巴转移者，提示肿瘤是否发生淋巴转移与局部免疫反应有密切关系。

本研究还发现宫颈鳞状细胞癌内的Foxp3+细胞浸润数量较肿瘤周围多。说明肿瘤内微环境中，T细胞介导的免疫反应受到了抑制。类似的差异也见于许多实体肿瘤，如胃癌、肺癌等。肿瘤局部Foxp3+Treg细胞数量反映了在肿瘤内部宿主与肿瘤之间的免疫活动。有效的抗肿瘤免疫反应能抑制肿瘤细胞的潜在侵袭性，具有免疫抑制能力的Foxp3+Treg细胞则可能放任肿瘤侵袭［8，9］。这也进一步可以解释，在较差临床分期的宫颈鳞状细胞癌组织中有高浸润的Foxp3+Treg细胞。可见，宫颈鳞状细胞癌局部微环境中免疫抑制与免疫效应作用的力量对比关系决定了局部的免疫状态，并影响甚至决定了肿瘤的进展方向，局部免疫效应作用越强越不利于肿瘤生长侵袭，局部免疫抑制作用越强越有利于肿瘤侵袭转移。

通过Cox单因素和多因素生存分析发现，宫颈鳞状细胞癌组织内Foxp3+Treg细胞数量的多少是宫颈鳞状细胞癌术后的独立预后因素。有研究［10］曾报道Foxp3+Treg细胞高浸润是胃癌的独立预后因素。可见，Treg对免疫环境起负性作用，局部高浸润Treg细胞可能直接导致宫颈鳞状细胞癌患者有较差的预后。其可能的机制主要是通过各种途径直接或间接抑制效应性T细胞的增殖，活化及抑制T细胞和NK细胞对肿瘤的杀伤作用［11］;引起DC细胞的凋亡［12］;竞争抑制IL-2［8］等影响效应T细胞对肿瘤的免疫应答。

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(收稿日期:2015-01-21)

文章编号:1002-266X(2015) 19-0061-03

文献标志码:B

中图分类号:R737.33

doi:10.3969/j.issn.1002-266X.2015.19.022