脊柱后纵韧带骨化发病机制的分子生物学研究进展

孔德谦 王俊勤 蔡国栋

(1.泰山医学院，山东泰安271016;2.泰山医学院附属医院骨科，山东泰安271000)

脊柱后纵韧带骨化发病机制的分子生物学研究进展

孔德谦1王俊勤2蔡国栋2

(1.泰山医学院，山东泰安271016;2.泰山医学院附属医院骨科，山东泰安271000)

韧带骨化病;脊柱;研究进展

韧带骨化病是一种好发于老年群体中的疾病，其好发年龄为50～60岁的个体。在60岁以上的老年性人群中，腰椎间盘突出、椎管狭窄、韧带骨化、脊柱肿瘤等一系列脊柱疾病占很高的比例，尤其是韧带骨化病在脊柱疾患发病率可高达15%－20%。在一般骨科疾病成人门诊中，此病的发生率可占1%－3%。脊柱韧带骨化病主要是以硬膜囊周围韧带骨化为主，经常发生的有以下几种疾病:颈椎后纵韧带骨化(OPLL)、黄韧带骨化症、胸椎后纵韧带骨化症等。颈椎后纵韧带骨化是目前临床经常遇见的骨化类型，较其他几种骨化类型发病率高。脊柱韧带在一系列的因子影响下由正常形态转变成为异常形态，即脊柱韧带的异位骨化，导致异位成骨出现。异位骨化的韧带使椎管变得较为狭窄，使硬膜囊在某点或某节段受压，从而脊髓神经受压，形成严重的脊髓病［1］。韧带异位骨化的进一步发展，在严重异位骨化的基础上能导致截瘫，对患者个体造成严重的身心疾患，对家庭及社会造成严重的经济负担。本病的病因至今仍不清楚，对于本病的发病因素仍停留在推测及学说阶段，而其他韧带骨化病的病因也无定论。目前对寻找脊柱韧带骨化病的致病因子，是防治脊柱韧带骨化病发生的最有效的办法，也为临床疾病的治疗提供新的思路。在众多分子研究机制中，本文对几种主要影响脊柱韧带骨化的分子做一论述。

1 骨形态发生蛋白(BMPs)的骨化作用

骨形态发生蛋白(bone morphogenetic protein，BMPs)是一组多功能细胞因子，其隶属于转化生长因子(TGF)超家族。在对间充质细胞迁徙、增殖、分化方面有重要的诱导作用，可以导致软骨和骨形成。另一方面BMPs对骨原细胞的分化也起主要的决定性作用。一系列的研究证明，BMPs是促进成骨的重要因子［2］。Deckers MM［3］与Bouletreau PJ［4］研究发现:利用细胞培养技术，对成骨细胞、骨髓细胞、间充质细胞进行体外培养，在不同阶段对BMPs和VEGF的浓度进行测定，发现在两者共同存在时其相同阶段的某一分子的浓度及表达量要高于单一因素，说明两者可以相互促进表达。段小军等［5］在对人骨髓基质细胞进行培养时，以牛骨形态发生蛋白(BMPs)为诱导剂，发现碱性磷酸酶、Ⅰ型胶原、骨钙素表达明显增加。此研究结果表明:体外培养时，天然BMPs对人骨髓基质细胞向成骨方向的分化具有重要的作用。在众多BMPs的实验研究中，以对BMP－2的研究为主。Chen D等［6］在体内和体外实验研究都表明:BMP－2对成骨细胞分化和诱导体外成骨具有很强的促进作用。Onishi T［7］等认为BMP－2直接作用于成熟的破骨细胞，诱导其骨吸收活性，其认为BMPs在骨形成的各个阶段均有不同程度的表达。詹玉林等［8］通过Western blot检测显示，在对小面积的(0.5cm)骨缺损部位研究中发现，骨形态发生蛋白－2(BMP－2)的表达在损伤后1、3、4周呈逐渐增多的趋势，且在每组损伤中BMP－2表达量均较损伤时刻明显增加。洪亮等［9］构建的壳聚糖－磷酸钙/重组人BMP－2复合材料也证实了骨形态发生蛋白－2能在兔体内异位成骨。

BMP－4和BMP－6也是TGF家族成员。林霖等［10］以小鼠为模型，研究发现以BMP－4、脱钙骨基质及切断跟腱三个研究因子为研究对象，三种因子均可有效诱导异位骨化。李林等［11］以携带BMP－6腺病毒感染小鼠骨髓基质细胞(BMSC)，通过染色和定量检测碱性磷酸酶(ALP)、骨桥素(OPN)及骨钙素(OC)，其表达量明显上升。在基因检测试验中，BMP－6对转录因子Smad和成骨关键基因Runx2的活化中起着重要作用，也能促进小鼠BMSC定向成骨分化。综上所述，BMPs在骨细胞分化及异位骨化中起着重要的作用。

2 Runx2的骨化作用

Runx家族蛋白包含Runxl、2、3三种异构体，都有一DNA结合结构域runt。果蝇的成对控制基因runt序列与此结构域同源［12］，在多种细胞谱系Runx蛋白发挥着重要作用。Runxl参与造血干细胞分化。Runx3在胃上皮细胞调控中发挥重要作用。而Runx2对成骨具有重要的作用，主要影响成骨细胞分化、软骨细胞成熟及骨基质蛋白的产生。Runx2基因表达是一种细胞调控因子，众多的实验研究表明，Runx2其一个中枢的作用，几乎所用的成骨因子都对Runx2具有增强作用，是各种信号传达发挥作用的交汇点，在人体成骨中具有重要的地位。转化生长因子β－1(TGFβ－1)可以通过smad与P38、丝裂原活化蛋白激酶(MAPK)两种途径来刺激runx2基因，使其表达的runx2蛋白异常升高，促进其在人体的成骨作用，尤其在人体后纵韧带骨化骨化中起着重要的作用。

Enomoto H等［13］以小鼠为实验模型，运用目的基因敲除的方法研究Runx2的骨化功能。以Runx2为目的基因，对其实行基因敲除，可以发现小鼠膜内骨化成骨及软骨内骨化成骨均不能发生，说明Runx2为成骨分化所需的必要因子。

BMPs是骨化及成骨的重要因子，细胞膜上的Ⅰ型和Ⅲ型两种受体，BMPs能与受体特异性结合，可通过特异的蛋白(Samd)传递信号，发挥其骨化作用。Samd1、5、8能同Samd4形成复合物，此复合物可以激活目的基因促进其表达，从而促进成骨细胞的分化及异位成骨的形成。BMPs调控成骨细胞基因表达是一个复杂的过程。研究发现Samd1、5同Samd4形成的复合物具有增强子的序列，能同目标基因上的Samds结合元件结合，结合的Samds和其他的核因子能上调Runx2和osterix(OSX)基因的转录［14］。

成纤维细胞因子(FGF2)能迅速促进骨髓间充质细胞中丝裂原活化蛋白激酶激酶(MEK)的磷酸化和骨钙素(OC)mRNA的表达。Nugent MA等［15］对骨髓间充质细胞行体外培养，用FGF2处理骨髓间充质细胞，检测到Runx2的磷酸化水平明显增加，此实验证明FGF2可实现对Runx2蛋白的磷酸化调节，此调节过程是通过丝裂原活化蛋白激酶(MAPK)信号途径来实现的。另外一些实验研究也具有相同的结果，Boudreaux JM［16］及MacKenna DA［17］等研究结果也证明了力学信号的刺激与Runx2磷酸化具有明显的相关性。力学信号刺激人和大鼠骨髓间充质细胞能激活细胞外信号调节细胞外调节蛋白激酶(ERK)信号途径，同时拉动了Runx2磷酸化。Nakashima K等［18］依赖细胞外基质(extracellular matrix，ECM)激活Runx2基因转录，ECM能向成骨细胞发出分化信号，促进成骨细胞分泌骨钙素，说明Runx2在骨钙素的转录过程中起着重要的作用。

综上所述，Runx2在成骨细胞、软骨细胞的分化及骨和软骨的形成具有促进作用，且各个因子的促进骨化作用是以Runx2为枢纽的。

3 LMP－1骨化作用

LIM矿化蛋白(LIM mineralization protein，LMP)是一种细胞内的非分泌蛋白，其属于LIM结构域蛋白家族成员。它能够影响骨基质的矿化，是一种胚胎骨发育及成骨细胞分化过程中重要的正调节因子。LIM结构域是很多LIM蛋白行使其生物学功能的关键结构域，其能介导蛋白质与蛋白质的相互作用，并参与细胞的增殖和分化。LIM结构域是以Lin11、Isl－1、Mec－3三种同源蛋白质中的首字母命名。LIM结构域是一种含有55个氨基酸残基的序列，是由保守的组氨酸、半胱氨酸残基形成“口袋”状稳定的三级结构，其氨基酸序列为CX2CX16－23HX2CX2－CX2CX16－23CX2C(X代表其它氨基酸)，能够与Zn+结合［19，20］。

LIM结构域蛋白家族包含许多蛋白分子，LMP－1为其中一种。Boden SD等［21］在研究骨形态发生蛋白(BMPs)促进骨形成机制过程中，利用糖皮质激素刺激小鼠成骨细胞mRNA，并以反转录差异显示技术(DDRT－PCR)作为反应体系，同时设立对照组，在此体系反应过程中得到一种全新的cDNA片段，此cDNA片段部分基因区可以翻译并编码一种新的蛋白质。这种蛋白含有457个氨基酸，此蛋白质含有两个糖基化位点和多个翻译后修饰位点，其C端和N端分别含有LIM结构域和PDZ结构域( PDZ结构域是识别靶蛋白C端最末4－7个氨基酸的小球形结构域)，这种蛋白被称为LIM矿化蛋白－1。Viggeswarapu M等［22］利用腺病毒载体转导实验发现人体包含3种不同的LIM基因型。不同基因型的LMP在人体不同组织器官表达量是不同的，即使在同一组织器官的不同部位表达量也是不同的。LMP－1和LMP－2在人体大多数组织器官几乎均能表达。其中LMP－1在脾、肺、粒细胞等组织器官中的表达占有主导地位，骨骼肌中的LMP－2表达相对较高，而组织中的LMP－3表达范围比较局限。上述表达情况说明:在不同的组织器官中不同类型基因的表达及表达量可能存在不同的作用，并可能随组织分化和功能变化而表达不同基因类型表达量［23］。Bunger MH等［24］利用RT－PCR技术以人髂骨为标本，应用半定量分析的方法得到:LMP－1表达水平在年轻个体中高于LMP－2，此研究结果表明人类生长发育与LMPs的转录调节可能有密切的联系;LMP－2的表达和许多生长因子有关，尤其与BMP－2和bFGF关系更为密切。

LMP－1是一种胞内信号转导分子，在对胚胎骨发育的过程中的研究发现:肥大的软骨细胞被间充质细胞所包围，在这些间充质细胞中发现了一些LMP－1的转录物，说明LMP－1在成骨细胞早期分化中明显相关［20］。通过明前的实验研究，一些学者对LMP－1的作用持有不同的观点:LMP－1不能直接作为成骨及骨化诱导因子，而是通过刺激其它骨诱导分子(如BMPs)的合成及分泌发挥作用［25］。Boden SD［21］等对大鼠研究发现，糖皮质激素及BMP－6可以诱导LMP－1分泌，促进矿化结节的形成;过量表达的LMP－1又可以促进大鼠成骨细胞分泌BMP－2和成骨细胞的重要转录因子cbfa1;在通过对转染pCMV－LMP－1质粒7d后，BMP－2 mRNA及蛋白水平比原始水平提高数倍甚至数十倍;同样cbfa1 mRNA水平也比原始高于数个水平。Minamide A等［26］利用腺病毒载体Ad LMP－1将含LMP－1序列转染人肺癌细胞系。研究发现转染后多种骨形态发生蛋白(如BMP－6)及TGF－B1蛋白的表达明显升高;LIM矿化蛋白－1同样可诱导多种BMPs表达，体外实验证明LIM矿化蛋白－1转入48h后就能检测到BMP－4、BMP－7，同时在体内实验也证明LIM矿化蛋白－1转72h后也能检测到BMP－4、BMP－7。Yoon ST等［27］研究表明，以病毒携带LMP－1转染椎间盘细胞，BMP－2及BMP－7持续分泌，蛋白表达量明显上升，蛋白聚糖含量增加。

牙本质和骨组织有相同的间充质起源和组织形成过程。他们的起源及形成过程都包含细胞的分化、细胞外基质的分泌和矿化［28］。王效英、张旗等［29，30，31］利用基因扩增技术(RT－PCR)检测LMP－1及其相关因子(BMP－2、BMP－6、BMP－7、Cbfa1)在人牙髓细胞的分化及矿化结节的形成过程中的表达情况。发现它们在不同的分化阶段表达量均呈上升趋势。此体外实验的进一步研究，为下一步的人牙髓细胞的分化及矿化结节提供了良好的理论依据及实验室基础。此外，在牙周膜细胞体外实验中，矿化结节的形成颗粒的多少、骨涎蛋白及碱性磷酸酶的表达量明显高于对照组。另外，一系列体内外实验研究表明［29，30，31，32］LMP－1在正常及病理状态下的牙本质及牙周膜细胞中均有表达，可以推测LMP－1在此种过程中发挥着重要的作用。Sangadala S等［33］的研究表明LMP－1可以与Smads泛素化调控因子1(Smad ubiquitin gulatory factor 1，Smurf1)相互作用，抑制Smads的普遍表达性。在LMP－1介导的骨形成区域，有1个可以直接与Smurf1－WW2结构域相互作用的区域，该区域可以有效地与Smad1、Smad5竞争性结合。LMP－1通过Smurf1－WW2域相互作用来阻断Smurf1与Smad的结合，从而导致细胞对外源性BMPs的敏感度增加，有效地促进了骨形成，为LMP－1及BMPs信号路径的调控机制提供了新的理论。

综上所述，胞内信号分子LMP－1可能促进细胞分泌多种细胞因子(如BMPs)，同时也使周围许多细胞加入骨化行列。即使细胞表达相对较少的LMP－1也可以有效地促进骨形成，通过放大效应来发挥作用。根据以上实验研究结果，LMP－1在骨形成及骨化中起着重要的作用，同时也为LMP－1对后纵韧带骨化的形成机制提供了一个新的思路。

4 其他因子的骨化作用

在一系列实验研究过程中，发现骨骼的生长发育过程中受到多种因子的调控(如雌激素、甲状旁腺素、维生素D、碱性磷酸酶、胰岛素)。在许多OPLL的患者同时伴有上述激素水平表达比较混乱时，OPLL骨化更为明显。Horikoshi T［34］实验证实在OPLL周边软骨细胞中发现，IGF－1表达水平较高，其可促进软骨细胞骨化及细胞外基质形成。

目前对后纵韧带骨化作用的研究还包括许多因子，如易感基因、机械刺激、酶等，研究发现它们与细胞分化、成骨及异位骨化有密切关系，但在众多关系中主要因子的分子机制目前还不清楚，需进一步研究。

5 结语

目前对于后纵韧带异位骨化的作用机制取得了重大的进展，但对于许多作用机制还不甚了解，或者某一机制不能全面概括异位成骨的步骤。因此，多因素多层次导致了后纵韧带骨化，目前以分子作用机制来探讨发病机制，从根本上来预防本疾病的发生，也为本病的治疗提供先决条件。

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R686

:A

:7115-1004(2015)06-0714-04

10.3969/j.issn.1004-7115.2015.06.047

2015－1－13)

孔德谦，泰山医学院在读硕士。

蔡国栋。