猪流感的检测与诊断

猪流感的检测与诊断

成大勇 （内蒙古赤峰市家畜改良工作站 024031） 翁善钢（外高桥出入境检疫局 上海 浦东）

猪流感病毒(swine influenza virus，SIV)是猪常见的病原体之一。SIV为正粘病毒科甲型流感病毒属成员。各种年龄、性别和品种的猪均能感染，母猪群中检测出甲型流感病毒阳性的概率相对较高。临床上往往表现为急性呼吸道疾病，主要症状有发热，厌食，体重减轻，嗜睡，咳嗽，呼吸困难，鼻和眼有分泌物排出。母猪会出现繁殖障碍和流产。此外，感染流感病毒之后还会继发细菌性感染。猪流感发病率高，恢复缓慢，阻碍增重，降低料肉比，直接影响猪群健康状态和质量，是规模化养猪场普遍存在且难以根除的猪群发性疾病之一，对养猪业危害极大。自1918年首次报道猪流感以来，迄今为止，世界各大洲均有猪流感的发生和流行。迄今已发现的甲型SIV有HINl、H1N2、H1N7、H2N3、H3N1、H3N2、H3N3、H3N6、H4N6、H5N1和H9N2等11种不同亚型。猪群中流行的SIV亚型主要有H1N1、H3N2和H1N2三

种。其中，H1N1病毒于1930年在美国首次分离出来。2009年3月在墨西哥、美国等地暴发的甲型H1N1流感病毒，是一种新型的变异病毒株，这种新型流感病毒具有病毒杂交特性，它包含人流感病毒、禽流感病毒和猪流感病毒的基因片段，同时拥有亚洲猪流感和非洲猪流感病毒特征。因此，猪流感不仅给畜禽养殖造成重大经济损失，而且还对人类健康造成威胁，因此快速、敏感、准确诊断猪流感，具有重要的经济价值和公共卫生意义。作为一种重要的人畜共患病，目前已有多种检测和诊断方法用于SIV感染。

1 检测样品的采集

（1）用于直接检测的样品需要在SIV复制和向外排毒期间采集。通常是感染SIV后的1～8d。抗体反应通常在感染的7～21d后能够检测到。一般在感染后2～4周后采集血清样品用于检测抗体。样品应在采集后的48h内送至实验室进行诊断。（2）采集猪的唾液以及鼻腔分泌物样品对检测猪流感病毒十分有用。由于唾液收集相对容易，对唾液样本的检测已成为重要的诊断筛查方法。唾液样本的采集可以采用灭菌的棉签，采集过程中避免有外来污染，如饲料，粪便和有机物质。（3）唾液样品可能很难从新生仔猪中采集。断乳仔猪，生长猪以及成年猪采集唾液样本比较容易。唾液样品的缺点是可能会存在影响RT-PCR检测的抑制剂。此外，样品中病毒含量较低有可能会影响到测序或病毒分离。鼻试子样品用于测序或病毒分离由于唾液样品，因为其样品中的病毒含量较高。

2 病理学诊断

对因SIV感染而死亡的猪进行病理学诊断是一种重要的方法。病理学观察所需的样品包括使用福尔马林固定的新鲜肺组织、气管以及肺灌洗液。流感病毒感染的肺组织通常呈紫红色。病理学观察可以看到肺部的呼吸道(支气管或细支气管)上皮坏死。肉眼或显微镜下观察到病变加上RT-PCR检测呈阳性可以用作流感的确诊。

3 实验室诊断

3.1 电镜技术 通过电镜能够观察到病毒粒子。SIV病毒粒子呈椭圆形，棒状和圆形，直径约为80～120nm。虽然电镜技术直接、客观，但是对病毒滴度不仅要求高，设备昂贵，而且需要熟练的技术操作人员，因此，电镜用于临床检测的价值较低。

3.2 病毒分离和鉴定 从待检病料样品中分离和培养SIV在检测宿主范围和致病机理的研究及疫苗生产等方面都很重要。猪流感病毒可在鸡胚和培养细胞中增殖，由于鸡胚中增殖敏感性高，通常被称为猪流感诊断的“金标准”。但是病毒分离出来之后，还需要多种方法进一步鉴定确诊。

3.3 血清学诊断 常规SIV的亚型鉴定最实用的确诊方法是血清学诊断技术，即红细胞凝集(HA)试验、血凝抑制(HI)试验、神经氨酸酶抑制(NI)试验、中和试验(SN)、琼脂凝胶扩散试验(AGID)、免疫荧光法(IFA)、酶联免疫吸附试验(ELISA)、免疫过氧化酶单层细胞试验(IPMA)、免疫组织化学(IHC)试验。这些传统的血清学诊断方法往往操作繁琐，诊断时间长，结果重复性不好，限制了传统方法在实际中的应用。例如IHC是一种可用于诊断猪流感的检测方法，但需要将脏器组织使用福尔马林进行固定。IHC方法主要用于鉴定肺脏上的流感病毒抗原。但是福尔马林固定以及脏器的选择会影响到检测的特异性和敏感性。

3.4 分子生物学诊断 传统诊断方法在病毒的初次分离和亚型鉴定中仍然起着重要的作用。随着分子生物学的发展，应用分子生物学诊断技术进行猪流感快速诊断和鉴定已成为国内外研究猪流感的重要手段之一。分子诊断技术具有特异性好、灵敏度高、针对性强、诊断快速等优点。逆转录聚合酶链反应(RT-PCR)是实验室检测常用的分子生物学方法。检测的样品可以是唾液、鼻分泌物和肺组织等。RT-PCR可用来鉴定分离的病毒，也可直

接用于临床病料的检测，因此，RT-PCR能对SIV作出早期诊断。随着RT-PC技术的不断发展，目前已经能够用于检测不同流感病毒的亚型，即确定感染的病原是H1N1、H1N2、H3N2或其他亚型的流感病毒。实时荧光定量RTPCR的方法用于SIV的检测也早有报道。

除此之外，其他的一些分子生物学诊断方法如依赖核酸序列的扩增法、核酸探针、基因芯片、蛋白质芯片、内源性病毒编码酶检测法等也都有用于SIV检测的报道。这些技术在用于SIV方面各有特点和优势。例如，利用基因芯片技术能够用来检测1-16亚型的甲型流感病毒，并且还可以对当前流行的甲型H1N1流感病毒进行特异性检测，还可以对H1，H3，H5，H7，H9亚型流感病毒进行分型检测。

总之，随着技术的进一步发展，将SIV的传统诊断方法和现代的分子生物学诊断新技术有效地结合起来，不断改进诊断方法和技术，这肯定能够为防控猪流感提供必要的技术保障。

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1007-1733(2015)09-0038-02

2015–05–23）