急性髓系白血病患者骨髓单个核细胞FANCF表达变化及意义

邓娜，娄晔，于艺冰，王晓鸥，樊华(中国医科大学附属第四医院，沈阳00; 大庆市油田总医院; 秦皇岛市第一医院)

急性髓系白血病患者骨髓单个核细胞FANCF表达变化及意义

邓娜1，娄晔2，于艺冰3，王晓鸥1，樊华1
(1中国医科大学附属第四医院，沈阳110032; 2大庆市油田总医院; 3秦皇岛市第一医院)

摘要:目的观察急性髓系白血病(AML)患者骨髓单个核细胞范可尼贫血蛋白FANCF的表达变化，并探讨其对疗效的判断价值。方法选择同期接受治疗的AML患者111例(观察组)及性别、年龄匹配的非AML患者42 例(对照组)。采用密度梯度法提取两组骨髓单个核细胞，免疫荧光法检测其FANCF表达。结果观察组骨髓单个核细胞FANCF阳性表达45例(40.5%)，对照组为40例(95.2%)，P＜0.01。观察组中，64例初诊患者单个核细胞FANCF阳性表达14例(21.8%)，27例经过化疗后完全缓解(CR)者26例(96.3%)，20例复发者中5例(25.0%) ; CR患者单个核细胞FANCF阳性表达率均高于初诊和复发患者，P均＜0.01;初诊和复发患者比较、CR患者和对照组比较，P均＞0.05。结论AML患者骨髓单个核细胞FANCF表达降低，FANCF检测有助于AML的疗效评价。

关键词:急性髓系白血病;范可尼贫血蛋白;骨髓单个核细胞

范可尼贫血(FA)是一种常染色体隐性遗传病，此类患者易患急性髓系白血病(AML)［1］、头颈部鳞状细胞癌、妇科癌症等［2］。目前，已发现至少15种FA蛋白［3～5］通过共同途径组成一个多蛋白核心复合物，其稳定性直接影响下游FA-BRCA途径发挥DNA修复作用［6，7］。FANCF是其中一种FA蛋白，通过FA通路参与细胞周期、细胞凋亡、DNA修复、基因转录与基因稳定性等多种生命信号的转导与调控［8，9］。在多种实体肿瘤中发现，FANCF表达降低或功能缺失与肿瘤的发生、发展相关［10～12］，而关于FANCF是否参与AML的发生及其调控机制尚未见报道。因此，我们观察了AML患者骨髓单个核细胞FANCF蛋白的表达变化，并探讨其意义。现报告如下。

1　资料与方法

1.1临床资料2006年9月～2014年7月中国医科大学附属第四医院血液科就诊的AML患者111例(观察组)，均符合《血液病诊断及疗效标准》中的AML诊断标准［13］。其中，男62例、女49例，中位年龄56岁;初诊64例，经过化疗后完全缓解(CR) 27例，复发20例。选择同期性别、年龄匹配的非AML患者42例(对照组)，其中巨幼细胞贫血16例、肾性贫血10例、缺铁性贫血5例、血小板减少性紫癜11例。

1.2方法

1.2.1骨髓单个核细胞提取采用密度梯度法。两组均行骨髓穿刺术，抽取骨髓液3～5 mL，肝素抗凝，缓慢注入4 mL淋巴细胞分离液。2 100 r/min离心20 min，取中间细胞层，PBS洗涤; 1 500 r/min离心5 min，弃上清;加入蒸馏水2 mL，破坏红细胞1 min;加入1.8% NaCl 2 mL，1 500 r/min离心5 min。弃上清液，沉淀即为分离的有核细胞，用PBS按105/片稀释。离心甩片机每孔滴加50 μL的PBS混悬液，甩片4张，离心后自然干燥待用。

1.2.2骨髓单个核细胞FANCF检测采用免疫荧光法。取单个核细胞甩片，置于室温孵育30 min，滴加多聚甲醛固定5 min，PBS冲洗; 0.2% Triton X-100通透10 min，PBS冲洗;山羊血清封闭15 min，加入兔抗人FANCF蛋白一抗25 μL，放湿盒置4℃过夜。PBS冲洗，加入荧光FITC标记二抗，37℃避光孵育30 min，自来水冲洗终止反应。荧光显微镜观察，胞质中呈现绿色荧光表明FANCF蛋白染色阳性;镜下随机观察100个细胞，计算阳性细胞百分比。其中，阳性细胞百分比≤5%为0分，5%～24% 为1分，25%～49%为2分，50%～74%为3分，≥75%为4分。染色强度评分:极弱的可疑荧光为0分，荧光较弱、仅能见明确可见的荧光为1分，黄绿色明亮荧光为2分，亮绿色耀眼荧光为3分。以阳性细胞百分比评分×染色强度评分表示，0为FANCF表达阴性，≥1为阳性。

1.2.3统计学方法采用SPSS18.0统计软件。计数资料比较采用χ2检验。P＜0.05为差异有统计学意义。

2　结果

观察组骨髓单个核细胞FANCF阳性表达45例(40.5%)，对照组为40例(95.2%) ;两组骨髓单个核细胞ANCF阳性率比较，P＜0.01。观察组中，初诊患者单个核细胞FANCF阳性表达14例(21.8%)，CR患者中26例(96.3%)，复发患者中5 例(25.0%) ; CR患者单个核细胞FANCF阳性表达率高于初诊和复发患者，P均＜0.01;初诊和复发患者比较，CR患者和对照组比较，P均＞0.05。

3　讨论

目前，FA途径已发现至少15种基因编码的15 个FA蛋白，它们通过共同途径组成一个多蛋白核心复合物。首先，FANCA、FANCB、FANCC、FANCE、FANCF、FANCG、FANCL和FANCM在细胞核内聚合，形成上游的E3泛素化连接酶复合体;其中，FANCA与FANCG、FANCB与FANCL在胞质中各自形成亚复合体，进入胞核内与FANCM作用，再与已在胞核内形成的FANCC和FANCE亚复合体相互作用。其中，FANCF使复合体更稳定，在FA通路中发挥重要作用。

FANCF基因位于11号染色体短臂的15号位点，其编码的蛋白与原核RNA结合蛋白ROM具有同源性，在维持通路完整性中的作用至关重要［14］。FANCF基因正常表达使FA-BRCA信号转导途径能够发挥完整功能，对细胞具有保护作用;然而，FANCF功能的破坏能够明确引起卵巢癌、口腔癌、肺癌和宫颈癌等实体肿瘤发生［17～19］。推测其机制可能因为FANCF是一种损伤修复蛋白，FANCF低表达或功能缺失，致使FANCD2蛋白不能泛素化; FA通路被破坏，使FA通路的修复、细胞周期与凋亡调控、生命信号转导等功能受损，细胞失去保护机制，导致细胞染色体不稳定，抵御外来损害的能力下降，而最终发生恶性转化。本研究中，AML患者骨髓单个核细胞FANCF阳性表达率显著低于对照组。提示FANCF表达下降在AML的发生过程中可能具有一定作用，与娄晔等［15，16］的研究结果一致。

本研究发现，CR患者单个核细胞FANCF阳性表达率均高于初诊和复发患者(P均＜0.01)，但是初诊和复发患者比较、CR患者和对照组比较均无统计学差异(P均＞0.05)。说明FANCF蛋白随着化疗疗效的不同，其表达水平也存在显著性差异。在AML的发病与转归过程中，FANCF表达先降低再恢复，这一变化规律有可能成为辅助判断疗效及方案调整的指标之一。这可能是由于CR患者FANCF表达恢复，使下游的FANCD2单泛素化，FA通路修复功能恢复，细胞恢复抵御外来损害的能力而发挥正常功能。

总之，AML患者骨髓单个核细胞FANCF阳性表达率降低，而其中CR患者单个核细胞FANCF阳性表达率均高于初诊和复发患者。说明FANCF表达降低与AML的发病有关，FANCF检测有助于AML的疗效评价。但是，FANCF在AML发生、发展以及化疗敏感性中的作用机制尚不清楚，将来需要更大样本、更深入的研究来验证。

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(收稿日期:2015-01-31)

通信作者:樊华，E-mail: fanhua66cn@163.com

基金项目:国家自然科学基金资助项目(30670887)。

文章编号:1002-266X(2015) 20-0034-03

文献标志码:B

中图分类号:R733.7

doi:10.3969/j.issn.1002-266X.2015.20.011