血清miRNA对中医辨证论治的指导意义*

刘俊峰 莫秀梅 孟威威 陈达灿

广东省中医院(广州 520120)

·学术探讨·

血清miRNA对中医辨证论治的指导意义*

刘俊峰 莫秀梅 孟威威△陈达灿▲

广东省中医院(广州 520120)

目的：探讨血清miRNA对中医辨证论治的指导意义。方法：分析血清miRNA及中医证的特点，miRNA表达的时序性和特异性与证候的动态变化非常相似，将血清miRNA引入中医药辨证论值得研究领域关注，从而阐明中医证候的实质及科学内涵。结论：血清miRNA可以作为微观辨证的指标与宏观辨证相结合提高辩证的准确性，也可为临床个体化治疗提供重要的指导作用。

miRNA是一类长约21～25个核苷酸的小分子非编码RNA，通过碱基配对的方式结合到靶mRNA的3’端，从而在转录后水平调节内源性基因的表达，影响蛋白质的合成，是一类十分重要的转录后调控因子。miRNA不但具有高度保守性、器官组织特异性，而且可以通过精确地调控靶基因的表达而参与细胞发育、分化、增殖、凋亡等生物学过程。近年研究发现血液中的miRNA的异常表达与多种人类疾病密切相关，血清miRNA有可能成为疾病诊断、治疗及预后判断的新兴分子生物标志物。辨证论治是中医认识及治疗疾病的最基本原则，也是最具特色的诊断和治疗方法，本文主要探讨血清中miRNA对辨证及治疗的指导作用。

1 血清miRNA 血清miRNA有2种来源，一种是由凋亡细胞或坏死细胞裂解过程中被动渗漏产生的，通常发生在肿瘤增殖转移或者慢性炎症的发生发展过程中，由于组织或者细胞破裂，miRNA则从细胞中被动渗漏到血液[1]。另一种是由于细胞微囊泡主动分泌产生的，微囊泡可能是运输循环中miRNA的主要载体，在细胞中miRNA首先被装载入分泌囊泡之中，随后伴随微囊泡的分泌而进入循环系统之中；在细胞培养液和人体外周血液的微囊泡中都含有miRNA。尽管循环中miRNA的来源尚未完全阐明，循环血中miRNA是对某种疾病的病理生理过程主动适应的介质，它们的变化可能在细胞通讯、蛋白转运和调控免疫细胞功能等多个方面起着重要作用。也有报道血浆室温放置24h或多次反复冻融，对血浆中miRNA分子几乎无影检测血清中miRNA不仅创伤小、方法简便，而且结果准确较可靠，对于提高疾病诊断、分类及预后的精度有重要作用。miRNA已具备了疾病生物标志物的特点。目前为止，血清miRNA表达谱的检测技术已经成熟。因此，血清miRNA有望成为疾病诊断、治疗和预后判断的新兴分子生物标志物。

2 miRNA与中医证之间的关系 证候研究是中医基础理论研究的一个至关重要的科学问题。中医的“证”是指在疾病的发生发展过程中具有内在联系，且能够反映疾病过程中某一特定阶段的病理病机，也是机体对致病因素反应的一种功能状态。中医证候包括证候病机和与其密切相关的症候群两个部分，具有抽象与具体的双重特性，而且证候的发生与发展是一个动态变化的过程，蕴涵着不同的层次、变量和时相性等多维特征，具有整体性、传变性、时空性及个体差异性等特点。“有诸内必形诸外”，证候体现了从分子、细胞及组织器官的动态演变。随着miRNA研究的不断深入，越来越多的证据表明miRNA具有2大特征，首先，在不同组织、器官、细胞的生长发育过程中，miRNA 表达谱存在很大差异，揭示了 miRNA 的表达具有时序特异性与组织特异性；另外，每种 miRNA 有多个潜在靶基因；对于不同细胞或者同一细胞的不同状态，某一特定 miRNA可调控的靶标是不完全相同的，是动态变化的，揭示了miRNA 的表达具有时空动态变化的特性[2]。

中医的“证”有即时性与差异性的特点，因为其是某一阶段的情况，所以会处于不断的动态变化之中；miRNA具有精确特异的时空表达特点，参与很多种疾病的发生与发展，二者有相似的特性。miRNA及其表达的动态变化过程与临床表现的症状和体征有内在的联系，其可能参与了证候的发生与动态变化。

3 血清中miRNA在中医证型研究中的应用 目前，循环中的miRNA与中医证型的研究还比较少，仍处于初步探索阶段。Zhang[3]等研究发现慢性乙肝辨证为肝胆湿热证和肝肾阴虚证患者的血清中miR-583、miR-663、miR-1299的量明显高于正常对照组，而且肝胆湿热证患者的血清中miR-583、miR-663的量明显高于肝肾阴虚证组和正常对照组，由此可以推断miR-583、miR-663可作为慢性乙肝不同证型的生物标记物。Chen等[4]进一步对慢性乙肝辨证属肝胆湿热证、肝郁脾虚证和肝肾阴虚证患者血清中的miRNA进行分析，研究表明3种中医证型患者血清中的miRNA表达谱明显不同，随后采用Pathway和GO功能分析研究表明慢性乙肝的3种证型分子机理也不相同，其中虚实夹杂证(肝郁脾虚证)与虚证(肝肾阴虚)本质上并不是接近的，而且二者较实证(肝经湿热证)更加复杂，虚实夹杂证较虚证发展为癌症进程的风险更高，研究同时表明血清中部分miRNA可能是由实证转化为虚证过程中的重要介质。以上研究表明将宏观辨证与微观辨证结合起来探讨证候的演变规律对中医辨证有一定的指导意义。

冯知涛[5]等将类风湿性关节炎(RA)患者分为风湿夹瘀型和肝肾亏虚型，研究发现风湿夹瘀型患者外周血miR-146a、miR-16水平高于肝肾亏虚型，红细胞沉降率(ESA)及C反应蛋白(CRP)也高于肝肾亏虚型，而类风湿因子(RF)低于肝肾亏虚型。风湿夹瘀型RA患者外周血miR-146a、miR-16的表达水平和ESR、CRP、RF等指标可为RA患者的辨证分型提供客观的参考。因此血清miRNA与疾病相关的实验室指标相结合可以作为中医辨证过程中潜在的分子标记物。

除了血液中的miRNA与中医的证有关外，研究表明唾液中及肿瘤组织中的miRNA与中医的证也有密切关系。SongGao[6]等研究发现胰腺癌患者唾液中一些特异的miRNA与中医证存在密切关系，结果显示miR-17、miR-21、miR-181b在湿热证中特异性表达，miR-196a在脾虚证中特异性表达，意味着miRNA在不同的证中发挥着不同的作用，这一研究在一定程度上也揭示miRNA可以作为中医证的分子标记物。李立平等[7]研究发现“脾胃湿热型”患者胃癌组织miR-449相对表达量明显低于其它证型，揭示了胃癌湿热之邪与miRNA的相关性。

4 中医药对血液中miRNA水平的调控研究 Chao Jiang等[8]研究发现脾肾亏虚型重症肌无力患者血清存在87个异常的miRNA表达谱，其中42个miRNA的表达高于正常对照组，45个miRNA低于正常对照组，采用中药健肌宁治疗后不但可以改善重症肌无力患者症状，而且45个低水平的miRNA中有43个明显上调，42个高水平miRNA中有35个出现下调，进一步采用生物信息学方法对miRNA表达谱及靶基因分析，发现血清中17个miRNAs的变化以及一些免疫细胞凋亡通路的抑制作用是中药健肌宁疗效的部分作用机制。以上研究表明，中医药可通过直接或间接对miRNA的调控从而起到治疗作用，进一步对结果采用统计学和生物信息学进行分析，得到方剂起效的相关miRNA表达谱，进而从miRNA水平揭示中医药治病的作用机制。

此外，有研究报道血清/血浆中miRNA还可反映肝脏损伤情况，用高浓度对乙酰氨基酚诱导小鼠肝损后发现血浆miR-22、miR-101b、miR-122及miR-192的表达与小鼠肝脏损伤呈时间及剂量依赖关系，而以血浆miR-122及miR-192作为分子标志物比用肝脏酶学指标评价肝脏损伤更敏感[9]。

5 血清中miRNA对中医辨证论治的指导意义

5.1 宏观与微观辨证结合，提高中医辨证的准确性 血清的清洁、无创、快速的特性使血清中miRNA在各类疾病生物标记物研究中优势明显。对中医而言，证候是研究的瓶颈，目前研究发现不同中医证型患者血清miRNA的表达不同，对于中医的辨证已经出现整体与血清miRNA或者与其它实验室等微观指标相结合的系统性研究。微观辨证可弥补宏观辨证的不足，这种思路有助于辨证的客观性和准确性，从而指导临床的处方用药。此外，将血清miRNA引入中医辨证论治的研究体系中，使用芯片技术及生物信息学，通过建立与证候有关的miRNA调控网络，很有可能从转录后水平阐明 “中医证”本质的科学内涵。

5.2 血清miRNA可作为中医药疗效预测的生物标记物 21世纪临床医学的特征是个体化医疗，其本质就是基于生物标志物的医疗选择。对于一些具有异质性的疾病而言，由于个体差异较大，不同的个体对于同一治疗的反应也不同，对于中医药治疗疗效确切的疾病，将患者血清miRNA或者与其它实验室指标结合作为疗效预测的生物标记物，在临床过程中将患者分层，实施个体化治疗，提高临床疗效的同时，做到科学、合理、安全的用药。目前采用血清miRNA作为中医药疗效预测的生物标记物尚未见相关的研究报道，这也是以后的研究方向。明确中医不同证型患者血清miRNA表达谱的不同以及中医药疗效预测的生物标志物，可为最终实现个体化治疗奠定基础。

[1] Zen K，Zhang CY. Circulating microRNAs：a novel class of biomarkers to diagnose and monitor human cancers[J].Med Res Rev，2012，32：326-348．

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[4] Chen QL，Lu YY，Zhang GB，et al.Characteristic Analysis from Excessive to Deficient Syndromes in Hepatocarcinoma Underlying miRNA Array Data[J]. Evid Based Complement Alternat Med，2013：1-8.

[5] 冯知涛，李 娟，任 洁.类风湿关节炎患者外周血miR-146a、miR-16的表达水平及临床指标与中医证型的关系探讨[J].热带医学杂志，2011，11 (11)：1226-1229.

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[9] Wang K，Zhang S，Marzolf B，et al.Circulating microRNAs，potentional biomarkers for drug-induced liver injury. [J] Proc Natl Acad Sci U S A，2009，106(11)：4402-7.

(收稿2015-02-03；修回2015-03-16)

*广东省财政厅课题[粤财工(2013)]

△广州中医药大学( 广州 510405)

▲通讯作者

血清/诊断 miRNA 辨证论治

R242

A

10.3969/j.issn.1000-7369.2015.07.065

广东省中医药管理局课题(20142066)

广东省中医药强省建设专项中医优势病种突破项目[粤财社(2014953)]