液相色谱—串联质谱检测田七花总皂苷中三七皂苷R1的含量

陈玉勇　秦枫　朱善元　黄文强　卞欢

摘要：建立了检测田七花总皂苷中三七皂苷R1含量的高效液相色谱-串联质谱（HPLC-MS/MS方法。用BDS HYPERSUL C18（150 mm×21 mm，5 μm色谱柱，以乙腈-水为流动相进行梯度洗脱，流速03 mL/min，柱温30 ℃；质谱分析采用三重四杆质谱仪，多反应检测（MRM模式，[JP2]电喷雾离子源（ESI负离子检测，定量分析的离子为：三七皂苷R1 m/z 9317→7996，内标物紫杉醇m/z 8525→5253。三七皂苷R1标准曲线的线性范围为00476～119 μg/mL，平均加样回收率为9933%，RSD为165%（n=6。精密度、稳定性、重现性均符合样品分析的要求。

关键词：田七花；三七皂苷R1；高效液相色谱-串联质谱

中图分类号： Q94683+84；O65763文献标志码： A

文章编号：1002-1302（201412-0319-03[HS][HT9SS]

收稿日期：2014-07-07

基金项目：江苏省高校“青蓝工程”科技创新团队资助项目；江苏省泰州市科技支撑（农业计划（编号：TL0719。

作者简介：陈玉勇（1978—，男，江苏泰州人，博士研究生，讲师，主要从事食品生物技术、食品分析等研究。E-mail：chenyuyong@tomcom。

通信作者：秦枫，硕士，副教授，从事天然药物及食品新资源开发等方向研究。E-mail：qinancy922@tomcom。

田七花为五加科植物田七[Panax notoginseng （Burk FH]的干燥花蕾，田七花作为云南文山州的传统生物资源，广泛应用于食品、保健品以及中药药材。例如，当地常用田七花泡茶[1]，制作点心，或与其他食材一起制成滋补品，长期食用对于治疗高血压、咽痛音哑和养生都颇有裨益[3-4]。田七花中含有皂苷、多糖、挥发油等多种化学成分，其中，皂苷是其主要生理活性成分，杨明晶等发现田七花苷没有毒性作用[7]，故近年来，将田七花进一步开发为保健品的研究较为热门。Yang 等已经从田七花中鉴定出170种单体皂苷，发现三七皂苷R1是皂苷中的一种主要成分[8]。目前，关于田七花中三七皂苷R1含量检测的方法有比色法[9]和HPLC法[10-11]等，但是比色法只能检测其中总皂苷的含量，HPLC法运行时间一般在15 min以上，且灵敏度低、专属性差。因此，笔者参照文献[12]对试验条件进行优化，建立了 HPLC-MS/MS 分析方法，该法能够灵敏地检测田七花蕾中三七皂苷R1的含量，可为三七花总皂苷（SFPN和以其为主要成分的保健食品的含量检测提供一定参考。

1材料与方法

11仪器

三重四杆质谱仪（API 4000型，配有电喷雾离子源（ESI，采用美国ABI公司的Analyst 141 数据分析系统；高效液相色谱仪（美国Agilent 1100；Q2200B型超声波清洗器（江苏省昆山市超声仪器有限公司；HH-S数显恒温水浴锅（浙江省金华市文华科教实验仪器厂；RE-3000旋转蒸发仪（上海亚荣生化仪器厂；SH-Ⅲ型循环水真空泵（上海亚荣生化仪器厂；Direct-Q3型超纯水机（江苏省苏州塞恩斯仪器有限公司。

12对照品与试剂

三七皂苷R1（批号：110745-201318，由中国药品生物制品检定所提供。紫杉醇（批号：100382-201201，购自云南省昆明科翔生物科技有限公司。田七干燥花蕾，由云南省文山壮族苗族自治州文山三七研究院提供。

D101大孔树脂购自江苏省泰州医药公司。乙腈、甲醇为色谱纯，水为超纯水，其余均为分析纯试剂。

13HPLC-MS/MS分析条件

131高效液相色谱条件

色谱柱为 BDS HYPERSUL C18（150 mm×21 mm，5 μm；流动相为水（A和乙腈（B，流速为[CM（25][G5]03[G2]mL/min，柱温为[G5]30[G2]℃，进样量为[G5]10[G2]μL。梯度洗脱方[CM]

[HS2]式为流动相B：20%[FY（]2 min[FY]30%[FY（]5 min[FY]75%[FY（]10 min[FY]90%。

132质谱条件

采用电喷雾离子源（ESI负离子检测，多反应检测模式（MRM。设制离子喷雾电压（IS为4 100 V；离子源雾化温度（TEM为450 ℃；去集簇电压（DP为-105 V；激发碰撞电压（CE为-47 V。采用的定量分析离子为：三七皂苷R1 m/z 9317→7996；内标物紫杉醇m/z 8525→5253。

14样品处理

141对照品及内标溶液的配制

称取三七皂苷R1 119 mg，[JP+1]以甲醇定容至10 mL，得到对照品储备液。称取紫杉醇101 mg，以甲醇超声溶解，定容至10 mL，再取该溶液100 μL以甲醇定容至10 mL，涡旋振荡溶解，即得内标溶液。

142供试品溶液的制备

参照Sun等的方法[13]，制备田七花总皂苷（SFPN。将田七干燥花蕾1 kg粉碎，过20目筛，以10倍质量70%乙醇回流提取3次，每次提取15 h。合并提取液，减压浓缩，并以适量水混悬，再分别以乙醚、正丁醇萃取，弃去醚层，收集正丁醇层，减压浓缩，抽干溶剂。将正丁醇萃取物经D101大孔树脂先以水洗脱，弃去洗脱液，再以90%乙醇洗脱，收集洗脱液，于45 ℃左右减压浓缩至干燥固态，即为田七花总皂苷（SFPN。共制备了5个批次的SFPN（批号分别为20130502、20130816、20130902、20131011、20131112。

称取对应批号的SFPN粉末02 g，加甲醇定容至10 mL，超声辅助溶解，得供试品储备液。取内标溶液100 μL和供试品储备液100 μL，加甲醇定容至1 mL，涡旋振荡溶解，经 045 μm 微孔滤膜过滤，得供试品溶液。

2结果与分析

21方法的专属性和特异性

按“13”节中液相色谱和质谱条件对SFPN中三七皂苷R1进行测定，记录色谱图。图 1为对照品和内标物总离子流图，图2为SFPN和内标物的总离子流图。在选定色谱条件下，被分析的化合物三七皂苷R1和内标物紫杉醇分别在约618 min和935 min时出峰，对照品和内标物的峰形和分离度较好，灵敏度强；同时采用保留时间和离子对的响应强度来进行分析，更有效避免了其他物质对这种皂苷测定的干扰，具有较好的专属性和特异性。[FL]

[F（W14][TPCYY1tif][F]

[F（W14][TPCYY2tif][F]

[FL（22]

22标准曲线与线性范围考察

以对照品储备液和内标溶液来配制不同浓度对照品溶液，将三七皂苷R1的浓度分别调至0047、0119、0476、119、476、119 μg/mL，进样量为10 μL。以对照品浓度为横坐标，以样品峰和内标峰面积之比为纵坐标，制作回归曲线，用加权（W=1/C2最小二乘法进行回归分析[14]，求得直线回归方程为y=33x+0027 8，相关系数（r为0999 8，线性范围为0047 6～119 μg/mL。

23精密度试验

对照品溶液连续六针进样，每次进样10 μL，进行精密度试验。计算对照品的峰面积和内标峰面积的比值，并统计出比值的RSD为185%，表明仪器精密度较好。

24稳定性试验

量取供试品溶液10 μL，分别在0、8、16、24 h时进样测定，计算对照品峰面积和内标峰面积的比值，并统计出比值的RSD为193%，表明在24 h之内供试品溶液的稳定性较好。

25重现性试验

取批号为20130902的SFPN样品，制备6份供试品溶液，[JP2]按“13”节的条件对样品中三七皂苷R1的含量进行检测。计算出样品的峰面积和内标峰面积的比值，并代入“22”节的回归方程，计算出三七皂苷R1的平均含量为056 mg/g，并统计出含量的RSD为159%，表明本方法具有较好的重现性。

26加样回收率试验

称取批号为20131011的已知含量的SFPN样品6份，每份02 g，按上述方法，制备样品储备液，取100 μL内标溶液和100 μL的供试品储备液，加入适量的对照品储备液，加甲醇定容至1 mL，溶解后，过045 μm微孔滤膜，得到供试品溶液，按上述方法操作，计算供试品溶液中三七皂苷R1的含量，计算回收率和RSD，结果见表1。

[F（W10][HT6H][J][WTH]表1三七皂苷R1的回收率测定结果（n=6[HTSS][STB][WTB]

[HJ5][BG（！][BHDFG3，W3，W42。5，W32W]样品号称样量（mg样品含量（μg/mL加入量（μg/mL测得量（μg/mL回收率（%RSD（%

[BHDG12，W3，W42。5DW，W32W]1200111121122209821

[BHDW]22000611211222810179

320026112112229821

4200151121122229911

51999211211222610089

6199791121122199777

平均9933165[HJ][BG）F][F）]

27样品含量测定

称取不同批号的SFPN样品3份，每份02 g，制备供试品溶液，按“13”节色谱条件进行操作，计算出样品的峰面积和内标峰面积的比值，并代入“22”节的回归方程，计算三七皂苷R1含量，结果见表2。

[F（W6][HT6H][J][WTH]表2田七花总皂苷中三七皂苷R1的含量（n=3[HTSS][STB][WTB]

[HJ5][BG（！][BHDFG12，W14，W15W]SFPN批号三七皂苷R1（mg/g

[BHDG12]20130502057

[BHDW]20130816055

20131112051[HJ][BG）F][F）]

3讨论

田七花的组成成分复杂，含有大量色素，在测定三七皂苷R1时，必须排除主要基质成分或色素成分的干扰。本研究参照Sun等所述方法[13]，以乙醚萃取去除叶绿素等脂溶性物质，以正丁醇萃取出大部分的皂苷类物质，再选用D101型大孔树脂进行柱层析，用水洗去多糖，最后收集90%乙醇洗脱液，此法可较好地对田七花皂苷类成分进行富集和纯化。

三七皂苷R1的最大吸收波长为203 nm，由于SFPN含有多种成分，紫外末端吸收多，采用普通的HPLC紫外检测器难以进行高灵敏度的检测，且专属性较差。皂苷类化学成分极性大、难挥发、热不稳定，经典的电子轰击电离（EI对其进行结构分析也很困难。使用ESI同时结合二级质谱分析，可以较快地获得结构信息。在选定内标物时，发现紫杉醇纯度高、易保存，与被测成分的化学性质相似，有较好的质谱响应，稳定性好，内源物质无干扰。本研究建立的采用负离子多反应监测技术的HPLC-MS/MS分析方法，灵敏度高、重现性好，符合食品样品分析的要求，较其他方法节省了大量的时间和成本[14]，可用于三七皂苷R1的定量分析，为不同田七花及其保健食品、药品的含量测定提供方法学参考。

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