嵌合抗原受体修饰T细胞在肿瘤免疫治疗中的研究进展

赵媛媛，孔宁，王毅

吉林大学药学院，长春 130021

*论著——肿瘤治疗技术*

嵌合抗原受体修饰T细胞在肿瘤免疫治疗中的研究进展

赵媛媛，孔宁，王毅

吉林大学药学院，长春 130021

近年来，作为新型肿瘤免疫治疗技术，嵌合抗原受体（chimeric antigen receptor，CAR）T细胞在恶性肿瘤的治疗中取得了很好的成果，为部分晚期患者带来了康复的希望。CAR是利用基因工程技术将能够与肿瘤抗原结合的受体部分与胞内的信号转导部分相结合而形成的一种新型受体，经CAR修饰的T细胞可通过非MHC限制性的方式杀伤肿瘤细胞。本文就近年来CAR-T疗法的研究进展及其在恶性肿瘤临床治疗的应用进行综述。

嵌合抗原受体；T细胞；肿瘤；免疫治疗

近几十年来，肿瘤的传统疗法（包括手术治疗、化学治疗、放射治疗等）取得了一定的效果，然而患者的生存率低、肿瘤复发和转移仍然是有待攻破的难题。随着研究的不断深入，肿瘤的免疫治疗逐渐成为可能会解决这些问题的途径。与传统抗癌疗法不同，肿瘤免疫治疗的靶标并不针对肿瘤细胞和肿瘤组织，而是针对人体自身的免疫系统。其中，使抗原抗体的高亲和性和T细胞的杀伤作用相结合，构建基于肿瘤特异性的嵌合抗原受体（chimeric antigen receptor，CAR）的T细胞免疫疗法发展非常迅速，通过基因转导使T淋巴细胞表达这种嵌合抗原受体后，T细胞在体内能够特异性地识别肿瘤抗原、有效杀伤肿瘤细胞。在近25年的时间里，嵌合抗原受体T细胞疗法（CAR-T）在体内实验和临床试验中均表现出良好的靶向性、杀伤活性和持久性，在治疗白血病［1-2］、淋巴瘤［3］、脑胶质瘤［4］和卵巢癌［5］等恶性肿瘤方面取得了令人欣喜的疗效。本文对CAR-T技术的研究进展及其在治疗恶性肿瘤的临床应用进行了如下综述。

1 CAR-T作用原理

T 细胞是人体内特异性抗肿瘤的效应细胞，但其发挥作用具有MHC （major histocompatibility complex，主要组织相容性复合体）限制性。1989 年，Gross等［6］首次提出构建特异性嵌合抗原受体（chimeric antigen receptor，CAR），即使T 细胞受体（ T cell receptor，TCR） 的亚基与肿瘤抗原单克隆抗体的单链可变区两者相结合，再通过一定途径将编码CAR的基因插入T细胞，修饰后的T细胞经体外扩增和纯化后回输入到体内，构建的 CAR-T细胞在体内既能特异性识别并结合肿瘤抗原，又具有T细胞自我更新和杀伤的能力。T细胞经基因修饰后获得了靶向杀伤活性，不受肿瘤局部免疫微环境的抑制，从而打破宿主的免疫耐受状态，使T细胞以非MHC限制性的方式特异性杀伤肿瘤细胞。

2 CAR主要结构

CAR的结构主要包括三部分：胞外抗原结合区、跨膜区以及胞内信号肽区。其中CAR的胞外区决定其特异性。胞外结合区的主要构成是肿瘤抗原特异性的单克隆抗体单链的可变区序列（轻链可变区和重链可变区由铰链区连接），其作用是特异性识别靶细胞表面的特异性抗原。CAR的跨膜区由CD3、CD4、CD28等构成。CAR的胞内信号区通常是T细胞受体TCR/CD3ζ链、免疫球蛋白Fc受体FcεRIγ链，这部分含有免疫受体酪氨酸活化基序（immunoreceptor tyrosine -based activation motifs，ITAMs），主要发挥信号转导功能［7］。

3 CAR结构发展历程

二十多年来，人们不断改进CAR的结构，如今CAR已发展到第4代。第1代CAR能够成功识别靶抗原并激活T细胞，但由于胞内信号肽区只表达单一的信号分子（TCR/CD3ζ链或免疫球蛋白Fc受体FcεRIγ链），缺乏协同刺激分子，从而不能充分激活T细胞，导致其修饰的 T 细胞增殖能力较低，细胞因子分泌水平也不高，无法在体内持续维持抗肿瘤效应。第2代CAR的信号区添加了一个协同刺激分子，因此在肿瘤细胞被CAR-T识别后，CAR中的协同刺激分子和胞内信号能够同时被活化，即实现双重活化，使T 细胞持久增殖并持续释放细胞因子，从而使细胞杀瘤活性大大提升［8］。第3代CAR在胞内信号区整合了2个以上的协同刺激分子，T细胞持续活化、增殖的能力得以实现，细胞因子的分泌得以持续，从而使T细胞增殖分泌能力和杀伤肿瘤细胞能力明显增强。第4代CAR（又称TRUCKs）在第3代CAR的结构基础上，又增加了编码CAR及其启动子的载体。这样，在转基因产生的细胞因子作用下，CAR能够产生更有效的信号； 此外，IL-12等细胞因子还可以招募免疫系统的其他成员，使得抗肿瘤免疫效应得以放大［9-10］。

4 CAR-T在临床治疗中的应用

传统的肿瘤治疗方式包括手术治疗、化学治疗和放射治疗等，而作为一种新型细胞免疫疗法，CAR-T所具有的优势是肿瘤传统疗法无法比拟的。CAR-T细胞能够特异性地杀伤肿瘤细胞，而对正常细胞损伤较小，并且没有放、化疗的毒副作用，因此耐受性较好。同时CAR-T能重建并增强患者机体的免疫功能，可长期对抗肿瘤。近年来，随着 CAR 结构的不断优化，CAR-T 也由实验室走向了临床试验［11］。

4.1 CAR-T应用于血液系统肿瘤的治疗

恶性淋巴瘤、白血病以及多发性骨髓瘤是常见的血液系统肿瘤，这几类肿瘤的发病率逐年升高，在恶性肿瘤中占较大比重。与放疗、化疗等传统疗法不同，CAR-T技术能够特异杀伤肿瘤细胞，毒副反应小，患者耐受性好，对难治性和复发性恶性肿瘤效果显著，在治疗血液系统肿瘤方面具有较好的效果。

4.1.1 B细胞恶性肿瘤

B细胞肿瘤的细胞表面表达肿瘤特异性抗原CD19，目前开展的B细胞恶性肿瘤临床试验大多是应用靶向的CAR-T细胞。B细胞以及95%以上的B细胞恶性肿瘤表面均特异性表达CD19，，并且CD19在B细胞的不同分化阶段均持续表达［12］。因此构建能够识别CD19分子的CAR-T细胞，对绝大多数B系肿瘤具有治疗作用。

Kochenderfer在2010年对一名难治性淋巴瘤患者复发后进行了CAR-T（CD19-CAR-T）治疗，治疗后病人的病情明显缓解了较长时间［13］。随后，Porter等一项利用CAR-T进行了白血病治疗的临床试验取得了成功，这一成果轰动了整个肿瘤研究领域［14］。Kochenderfer等在2014年公布了一项CAR-T疗法治疗B细胞肿瘤（CTL019）的最新研究数据，该项研究针对复发难治性急性淋巴细胞白血病，总共有39名儿童接受CTL019治疗，治疗后36名儿童（92%）达到了完全缓解，并且25名响应者在治疗结束6个月后仍处于缓解中，存活率达75%［15］。

除了构建CD19的CAR-T细胞， 还有研究者筛选新的靶标抗原，包括κ免疫球蛋白轻链［16］、BCMA（B-cell maturation antigen，B细胞成熟抗原）［17］、CD20［18］等，且许多研究均取得了较好成果。

4.1.2 急性淋巴细胞白血病目前大多数急性淋巴细胞白血病（acute lymphoi pneumonia，ALL） 患者不能够治愈，而CAR-T疗可能会缓解他们的病情。2013年《新英格兰医学杂志》报道了两例复发难治性ALL的儿童患者在接受抗CD19CAR-T细胞治疗后，两名患者均获得了完全缓解（complete remission，CR），同时在患者的脑脊液和骨髓中均发现了特异性T细胞［19］。Brentjens等报道了 5例复发难治性ALL成人患者在接受抗CD19CAR-T细胞治疗后也获得了完全缓解［20］。

4.2 CAR-T在实体瘤治疗中的应用

近年来，CAR -T 细胞在神经母细胞瘤、黑色素瘤、乳腺癌、前列腺癌等实体肿瘤中也显示出良好的抗肿瘤效应。

4.2.1 神经母细胞瘤

在治疗神经母细胞瘤的临床试验中，经第1代CAR-T修饰后的T细胞虽能成功进入患者体内，但由于其CAR结构仅有单一信号（CD3ζ或FcεRIγ），T细胞不能被有效激活，导致抗肿瘤效应持续时间较短，并未显示出明显的抗肿瘤效果。并且第1代CAR结合的单链抗体是鼠源，该CAR修饰的T细胞输入患者体内后会被患者自身产生的抗鼠抗体中和［21］。

随着CAR结构的不断发展，第1代CAR-T细胞逐渐被第2、3代CAR-T细胞所取代，从而广泛应用于临床试验：Louis［22］在治疗神经母细胞瘤的临床试验中发现，对处于活动期的神经母细胞瘤患者应用CAR-T细胞治疗后，患者病情得到完全缓解，取得了显著的抗肿瘤作用。

4.2.2 黑色素瘤

在Morgan［23］研究中，17 名转移性黑素瘤患者接受了CAR-T 细胞治疗（靶向人黑素瘤标志物，α-MART-1），其中肿瘤完全消退患者为2 例，其它15 例患者的外周血中持续存在高比例的回输T 细胞（ 9% ～ 56%） ，而且病情稳定。另外，Gargett［24］在治疗黑色素瘤的体外实验中，联合应用CAR-T与激酶抑制剂，实验结果显示二者联合应用具有协同治疗黑色素瘤的作用，提示该方法的临床应用前景非常广阔，有望进行进一步研究。

此外，还有以人类表皮生长因子受体2（human epidermal growth factor receptor-2，HER-2）、上皮黏蛋白（ mucin-1，MUC-1）为靶点治疗乳腺癌［25-26］，以癌胚抗原（carcinoembryonic antigen， CEA）为靶点治疗结肠癌［27］、以前列腺特异性膜抗原（ prostate specific membrane antigen，PSMA）为靶点治疗前列腺癌［28］等，多数都取得了一定的临床效果。

5 安全性挑战

CAR-T细胞疗法作为一种新型免疫治疗恶性肿瘤的方法，在其为晚期恶性肿瘤患者带来治愈希望的同时，其在治疗过程中的不良反应依旧需要得到重视，特别是一些致命的不良反应。因此在开展CAR-T细胞治疗的同时，还要重视CAR-T应用的安全性问题。

5.1 脱靶效应

首先就是脱靶效应，即大多数 CAR 定向的靶抗原不是肿瘤特有的，其在正常组织中有不同程度的表达， 因此CAR 修饰的免疫细胞在攻击肿瘤组织的同时也会损伤正常组织。因此可以使CAR-T细胞表达的嵌合抗原受体为两种或两种以上，而一般只表达一种抗原的正常组织细胞就可以避免受到CAR-T的损伤［29］，或者选择仅表达于肿瘤细胞表面的靶抗原，使之特异性结合于肿瘤细胞而不会结合到正常组织细胞。

5.2 细胞因子风暴

其次需要重视的不良反应就是“细胞因子风暴”。在第 2、3 代CAR中引入了 1 个或多个共刺激分子，使得细胞活化、增殖、杀伤能力大幅度增强，同时在细胞治疗过程中有多种细胞因子，如白介素（interleukin，IL）-1、IL-6、γ-干扰素等大量释放到机体循环系统中，引起恶心、头痛、心动过速、呼吸急促等临床症状，严重者可导致急性呼吸窘迫综合征或多器官功能衰竭，这就是所谓的“细胞因子风暴”［30］。针对这一问题，不仅要设计安全的CAR-T细胞，还要严格限制每次输注患者体内的细胞数量，从而降低该不良反应的发生。

6 展望

在肿瘤免疫细胞治疗领域，嵌合抗原受体T细胞疗法（CAR-T）代表当今最先进的技术，随着现代生物科学的发展，CAR-T越来越受到大家的重视。肿瘤的临床治疗和基础是现在肿瘤学研究的重点［31-32］。在肿瘤免疫治疗方面，CAR-T 的临床试验结果显示其有着无可比拟的优势，然而在技术提升和大规模临床应用方面，CAR-T仍然存在着许多挑战。如何提高CAR-T 细胞特异性杀伤肿瘤的能力以及用于临床治疗的安全有效性是目前CAR-T治疗急需解决的难题。随着研究的深入和技术的日益提高，相信CAR-T疗法一定会在肿瘤的免疫治疗中发挥越来越重要的作用，造福于医学发展和人类健康。

（References）

［1］ Mazzarella L. Tales from the Jazz ASH： highlights from the 2013 American Society of Haematology meeting ［J］. E cancer medical science， 2014， 8： 390.

［2］ Grupp SA， Kalos M， Barrett D， et al. Chimeric antigen receptor-modified T cells for acute lymphoid leukemia ［J］. N Engl J Med， 2013， 368 （16）： 1509-1518.

［3］ Kochenderfer JN， Rosenberg SA. Treating B-cell cancer with T cells expressing anti-CD19 chimeric antigen receptors ［J］. Nat Rev Clin Oncol， 2013， 10（5）： 267-276.

［4］ Chan JS， Yang YX， Han EQ， et al. Chimeric antigen receptor containing ICOS signaling domain mediates specific and efficient antitumor effect of T cells against EGFRvⅢexpressing glioma ［J］. J Hematol Oncol， 2013，6（1）： 33.

［5］ Lanitis E， Poussin M， Hagemann IS， et al. Redirected antitumor activity of primary human lymphocytes transduced with a fully human anti-mesothelin chimeric receptor ［J］. Mol Ther， 2012， 20（3）： 633-643.

［6］ Gross G， Waks T， Eshhar Z. Expression of immunoglobulin-T-cell receptor chimeric molecules as functional receptors with antibody-type specificity ［J］. Proc Natl Acad Sci USA，1989， 86（24）： 10024-10028.

［7］ Ramos CA， Dotti G. Chimeric antigen receptor（CAR）-engineered lymphocytes for cancer therapy ［J］. Expert Opin Biol Ther， 2011， 11（7）： 855-873.

［8］ Kowolik CM， Topp MS， Gonzalez S， et al. CD28 costimulation provided through a CD19-specific chimeric antigen receptor enhances in vivo persistence and antitumor efficiency of adoptively transferred T cells ［J］. Cancer Res， 2006， 66（22）： 10995-11004.

［9］ Pegram HJ， Lee JC， Hayman EG， et al. Tumor-targeted T cells modified to secrete IL-12 eradicate systemic tumors without need for prior conditioning ［J］. Blood， 2012，119（18）： 4133-4141.

［10］ Chmielewski M， Hombach AA， Abken H. Of CARs and TRUCKs： chimeric antigen receptor（CAR） T cells engineered with an inducible cytokine to modulate the tumor stroma ［J］. Immunol Rev， 2014， 257（1）： 83-90.

［11］ Melenhorst JJ， Levine BL. Innovation and opportunity for chimeric antigen receptor targeted T cells ［J］. Cytotherapy，2013， 15（9）： 1046-1053.

［12］ Scheuermann RH， Racila E. CD19 antigen in leukemia and lymphoma diagnosis and immunotherapy ［J］. Leukemia&Lymphoma， 1995， 18（5-6）： 385-397.

［13］ Kochenderfer JN， Wilson WH， Janik JE， et al. Eradication of B-lineage cells and regression of lymphoma in a patient treated with autologous T cells genetically engineered to recognize CD19 ［J］. Blood， 2010， 116（20）： 4099-4102.

［14］ Porter DL， Levine BL， June CH， et al. Chimeric antigen receptor-modified T cells in chronic lymphoid leukemia ［J］. N EngI J Med， 2011， 365（8）： 725-733.

［15］ Kochenderfer JN， Dudley ME， Kassim SH， et al. Chemotherapy-Refractory Diffuse Large B-Cell Lymphoma and Indolent B-cell Malignancies Can Be Effectively Treated With Autologous T Cells Expressing an Anti-CD19 Chimeric Antigen Receptor ［J］. J Clin Oncol， 2015， 33（6）： 540-549.

［16］ Ramos CA， Savoldo B， Liu E， et al. Clinical responses in patients infused with T lymphocytes redirected to target kappa-light immunoglobulin chain ［J］. BIOL BLOOD MARROW TR， 2014， 20（2）： S26.

［17］ Carpenter RO， Evbuomwan MO， Pittaluga S， et al. B-cell maturation antigen is a promising target for adoptive T-cell therapy of multiple myeloma ［J］. Clin Cancer Res， 2013，19（8）： 2048-2060.

［18］ Wang Y， Zhang WY， Han QW， et al. Effective response and delayed toxicities of refractory advanced diffuse large B-cell lymphoma treated by CD20-directed chimeric antigen receptor-modified T cells ［J］. Clin Immunol， 2014， 155（2）：160-175.

［19］ Grupp SA， Kalos M， Barrett D，et al. Chimeric antigen receptor-modified T cells for acute lymphoid leukemia ［J］. N Engl J Med， 2013， 368（16）： 1509-1518.

［20］ Brentjens RJ， Davila ML， Riviere I，et al. CD19-targeted T cells rapidly induce molecular remissions in adults with chemotherapy-refractory acute lymphoblastic leukemia ［J］. Sci Transl Med， 2013， 5（177）： 177-38.

［21］ Lamers CH， Willemsen R， van Elzakker P， et al. Immune responses to transgene and retroviral vector in patients treated with ex vivo-engineered T cells ［J］. Blood， 2011，117（1）： 72-82.

［22］ Louis CU， Savoldo B， Dotti G， et al. Antitumor activity and long-term fate of chimeric antigen receptor-positive T cells in patients with neuroblastoma ［J］. Blood， 2011， 118（23）：6050- 6056.

［23］ Morgan RA， Dudley ME， Wunderlich JR， et al. Cancer regression in patients after transfer of genetically engineered lymphocytes ［J］. Science， 2006， 314（5796）： 126-129.

［24］ Gargett T， Fraser CK， Dotti G， et al. BEAF and MEKinhibition variably affect GD2-specificchimeric antigen receptor（CAR） T-cell function in vitro ［J］. J Immunother，38（1）： 12-23.

［25］ Wang H， Wei H， Zhang R， et al. Genetically targeted T cells eradicate established breast cancer in syngeneic mice［J］. Clin Cancer Res， 2009， 15（3）： 943-950.

［26］ Maher J， Wilkie S. CAR mechanics： Driving T cells into the MUC of cancer ［J］. Cancer Res， 2009， 69（11）： 4559-4562.

［27］ Sasaki T， Ikeda H， Sato M， et al. Antitumor activity of chimeric immunoreceptor gene-modified Tc1 and Th1 cells against autologous carcinoembryonic antigen-expressing colon cancer cells ［J］. Cancer Sci， 2006， 97（9）： 920-927.

［28］ Zhong XS， Matsushita M， Plotkin J， et al. Chimeric antigen receptors combining 4-1BB and CD28 signaling domains augment PI3kinase/AKT/Bcl-XL activation and CD8+ T cell-mediated tumor eradication ［J］. Mol Ther，2010， 18（2）： 413-420.

［29］ Maus MV， Haas AR， Beatty GL， et al. T cells expressing chimeric antigen receptors can cause anaphylaxis in humans ［J］. Cancer Immunol Res， 2013，1（1）： 26-31.

［30］ Morgan RA， Yang JC， Kitano M， et al. Case report of a serious adverse event following the administration of T cells transduced with a chimeric antigen receptor recognizing ERBB2 ［J］. Mol Ther， 2010， 18（4）： 843-851.

［31］ 陈青，白定群.光化学转染对肿瘤治疗的研究进展［J］.世界复合医学，2015，1（2）： 162-167.

［32］ 何红晨，徐月萌，熊恩富，等.浅谈国际康复医学发展及启示［J］.世界复合医学， 2015， 1（2）： 130-133.

Nature：科学家首次发现抑郁症相关基因

2014年2月，当牛津大学遗传学家Jonathan Flint第一次发现某些基因序列和抑郁症的发生有关时，他非常吃惊。因为进行这种尝试的研究都相继失败，其中有研究从9000人重度抑郁症筛选敏感基因，也有对17000人进行随访分析的研究。而他自己项目的研究规模只有5303人。该项目中国合作单位有复旦大学、华东师范大学和中国医学科学院等。

但是Flint小组成功获得了结果。最近他们发表2篇论文报道其中2个重度抑郁症的基因标志。重度抑郁症是严重危害人类健康的重要疾病。世界上有超过3.5亿抑郁症患者，抑郁症的病情严重程度有很大差别，尤其是男女之间存在很大差别。这说明同样的抑郁症表现可能存在多种不同的遗传背景。但是早期关于抑郁症敏感基因的研究相继失败。Flint小组的发现将给寻找治疗抑郁症药物的研究提供重要线索，也能开发更准确的诊断抑郁症的重要工具。

分析结果发现了两个抑郁症相关突变部位，都位于10号染色体，一个突变位于SIRT1附近，另外一个是位于LHPP基因的一个内含子。LHPP基因是编码一种目前功能不完全清楚的蛋白酶，另一个是SIRT1基因。SIRT1基因是线粒体内重要蛋白酶。与线粒体基因相关也符合过去的一些研究。过去研究发现抑郁症和线粒体功能异常相关。线粒体功能异常会导致能量代谢功能紊乱，引起患者疲劳和兴趣丧失。看来抑郁症也是一种代谢性疾病，精神科医生应该学习吸收内分泌科的知识。

斯坦福大学精神病学家Douglas Levinson 对这一研究的设计非常有兴趣。他参与的Psychiatric Genomics Consortium曾经分析了17000抑郁症患者的基因数据，竟然没有发现抑郁症相关基因，受这一研究启发，他们将回头对研究数据进行再分析，尤其是如果将重度抑郁症单独分析，或许能有新的发现。

如果是这样，应该采集更多样本，寻找确认更多与抑郁症相关的基因。Levinson预计，未来5年内英国、荷兰和澳大利亚已经建立生物样本库的机构将可提供大规模的基因组分析数据，利用这些数据将能发现更多有价值的抑郁症相关基因，根据这些相关基因，将能帮助开发出真正具有针对性的抑郁症治疗药物，也将协助抑郁症的诊断和预测的基因手段。

Flint团队的成功将促进这一研究领域。这一研究也非常值得思考，关于抑郁症基因的研究，许多人认为这是愚蠢的研究，抑郁症不可能与基因有关，如果不坚持自己的设想，继续努力，这一研究可能早就放弃了。因此，选择了方向，就要坚持下去。做研究就要有不怕被别人耻笑的精神。

Research progress of chimeric antigen receptor-modified t lymphocytes in tumor immunotherapy

ZHAO Yuanyuan， KONG Ning， WANG Yi
School of Pharmaceutical Sciences， Jilin University， Changchun 130021

In recent years， as a novel tumor immunotherapy technology， chimeric antigen receptor（CAR）—modified T lymphocyte has made great achievements in immunotherapy technology for the treatment of malignant tumors， which has brought hope of recovery for part advanced patients. CAR is a kind of novel genetically engineered receptor which combines the antigen-binding region with the intracellular signal transduction region by genetic engineering technology. CAR- modified T Lymphocytes can kill tumor cells by means of non-MHC restriction. In this article， we highlight the applications of the CAR-T in the treatment of malignant tumor in recent years， and elaborate the development prospect in the future.

chimeric antigen receptor （CAR）； T lymphocyte； tumor； immunotherapy

R730.51

A

10.11966/j.issn.2095-994X.2015.01.03.11

2015-07-25；

2015-08-26

吉林省科技厅青年基金（20130522011JH）

赵媛媛，硕士研究生，研究方向为肿瘤疫苗，电子信箱：zyy100390@163.com；王毅（通信作者），博士，教授，博士生导师，研究方向为肿瘤疫苗，电子信箱： wangyi@jlu.edu.cn

引用格式：赵媛媛，孔宁，王毅.嵌合抗原受体T细胞在肿瘤免疫治疗中的研究进展［J］.世界复合医学，2015，1（3）：247-251