组织工程椎间盘支架材料的研究进展

莫日格乐 王跃文

综述与讲座

组织工程椎间盘支架材料的研究进展

莫日格乐 王跃文

椎间盘退行性病变引起的颈肩腰腿痛是临床最常见的疾病之一，而目前无论是手术或是非手术治疗的中远期疗效均存在一定的不足。近年来随着对椎间盘组织工程学技术的研究不断深入，椎间盘退行性病变的治疗也有了新的方向。而在椎间盘组织工程学中，如何构建适合搭载种子细胞的支架材料是目前的热点和难点之一。本文就椎间盘组织工程学中胶原蛋白、藻酸盐、壳聚糖及脂肪族聚酯均聚物等代表性支架材料研究中的进做一简要综述。

椎间盘；组织工程；支架

1 椎间盘退变特点及组织工程研究

椎间盘退变 (IVD)是目前引起人类颈腰腿痛最常见的疾病之一，其确切的发病原因尚不十分明确，目前的研究表明，椎间盘退变过程可能是一种异常细胞介导的反应，是由遗传因素、老化、椎间盘营养受损及负荷异常等引起局部稳定结构失效所导致，并且这种反应会不断进展[1]。通常人类在15～20岁即出现椎间盘的退变，而且随着年龄增长退变加重[2]，而椎间盘功能丧失主要是由于椎间盘营养供给差及不恰当的机械负荷导致细胞活力改变引起[3]。主要病理改变表现为退化的基质无法有效承载负荷，进而发生椎间盘退变，同时纤维环的层状结构开始退化，最后内部裂隙从内向外周扩大[4,5]。对于椎间盘的早期退变目前临床还缺乏行之有效的治疗手段，不管是非手术治疗还是手术干预，都无法恢复椎间盘的组织退变和已发生的功能丢失，所以设计开发符合椎间盘结构与生物学功能的材料，恢复并重建退变的椎间盘功能已成为治疗椎间盘退变的理想方案[6,7]。而组织工程技术的迅猛发展与其在骨科领域的应用，使早期治疗椎间盘退变有了新的方向[8]。组织工程在修复退变椎间盘方面主要有三大核心问题，即种子细胞的培养、信号因子复合嵌入、支架材料的选择与构建[9,10]，其中支架材料是构建组织工程椎间盘的关键环节[11]，而三维支架材料作为细胞生长的框架，对于维持椎间盘内合理的细胞空间分布和细胞联系及细胞的定向分化有着明显促进作用。它可以替代细胞外基质，为种子细胞的生长、分化、增殖及基质合成提供稳定的微环境，提供适当的机械性能和生化信号[12,13]。理想的支架材料应在良好的组织相容性、恰当的孔隙大小以及合适的降解性等方面具有共性外，还应与椎间盘细胞外基质在成分、性状、机械性能上相似[14]。

所以理想支架材料的功能应具备：呈三维结构并具有高度多孔的交叉孔隙网络结构，利于细胞生长、营养物质代谢及废物的运输；具有良好生物相容性和可控的生物吸收性，并且其降解速度应与体内外组织的生长、降解和吸收率相匹配；表面化学性质适合细胞附着，增殖和分化；机械性能与植入部位的组织特性相符[15]。实验中发现在三维立体环境中的种子细胞与普通的单层培养相比较，不仅细胞生长状态好而且功能更佳[16]。也有文献强调支架材料应与细胞具有良好的缝隙连接以利于细胞的黏附生长及血管神经长入，更重要的是应在恰当时机激活特异的基因表达，维持正常的细胞形态与功能，以利于种子细胞生长、分化及基质合成[17]。本文就近年来对支架材料方面文献报道较多的材料做一综述，探讨其研究进展。

2 组织工程支架材料

目前主要分为天然生物材料支架和人工合成材料支架。目前应用较多的天然生物材料主要有胶原、藻酸盐、壳聚糖、纤维蛋白凝胶、小肠黏膜、琼脂糖等；人工合成材料主要包括高分子有机材料聚乳酸、聚乙醇酸和生物陶瓷材料，如藻酸钙凝胶、透明质酸、磷酸钙、氨基葡聚糖、聚磷酸钙、聚氧乙烯、聚氧丙烯共聚物、羟基磷灰石等。如果按支架的形状又可以将其分为凝胶状、海绵状和纤维网状三大类。多数情况下，单一类型材料一般难以满足组织工程支架材料的要求，因此在近年来的研究中，常通过特定的方法将几种单一材料复合，以增强力学强度、改善降解速度、增加生物活性[18]，即所谓的天然-人工复合材料支架。现阶段大量天然材料和合成的高聚合物材料已用于组织工程椎问盘支架材料实验研究中，这其中要以胶原类和藻酸盐类细胞支架的文献报道为多，应用最为广泛。

2.1 胶原蛋白

目前在机体中已经发现并确认有超过25种胶原蛋白，约占人体蛋白总量的1/3。胶原蛋白的生物活性及生物功能强大，可对细胞的迁移、分化和增殖产生影响。它也是重要的结构蛋白，参与结缔组织的结构构建，支撑器官组织，维持机体功能。黏多糖和其他蛋白质构成的基质围绕在胶原的周围，使富含胶原的骨、肌腱、软骨和皮肤具有较好的机械强度。胶原蛋白特有的三股螺旋肽链结构可以确保其生物活性和生物相容性能良好，而与机体相适应的生物降解性及低免疫原性等特征已经使其成为椎间盘组织工程中较为理想的支架材料[19]。目前已发现有15种以单一存在方式或并存方式的胶原，其中I，II，III型胶原称为间质胶原，是人体中最主要的胶原。其余有称为基底膜胶原的IV型胶原和微量胶原V、VI型及IX型、X型、XI型等胶原，而在人类椎间盘中已确定至少有七个不同类型的胶原蛋白，有 I、II、III、V、VI、IX及XI型等。已经发现椎间盘的纤维环包含这些所有类型的胶原蛋白，而髓核只包含I、II、VI及IX型胶原[20]。其中II型胶原在椎间盘承载负荷能力等方面起主要作用，占胶原总量的90%[21]。在椎间盘的不同部位中的胶原含量也不一，在髓核中胶原占15%～20%，纤维环则为50%～60%，软骨终板可达到66%[22]。Halloran等[23]将3～4个月大的小牛尾骨椎间盘髓核细胞初步培养后，置于富含II型胶原、蛋白聚糖和透明质酸的支架上培养，结果表明相对于非交叉联合型支架，交叉联合支架更有利于细胞生长增殖，并可以稳定细胞表型的表达。Bara等[24]用以I型胶原为主要材料构建的支架对细胞进行培养后发现，多种蛋白聚糖与 I、II型胶原发生大量聚集，但即使是进行了60天培养，蛋白聚糖的浓度也未能超过10%，而且多位于支架周围，而非支架内部，这对支架内部的细胞生长是不利的。Huang等[25]用II型胶原、透明质酸跟硫酸软骨素通过化学共价键构建成共聚物，建立混合型组织工程髓核支架，将兔髓核细胞种植到支架上，培养28天后，通过评估髓核细胞增生情况及活力后发现，髓核细胞外基质相关基因的表达与硫酸化糖胺多糖 (s-GAG)水平提高，并且支架上有细胞外基质广泛沉积。Sakai[26]在体外用3%和0.3%两种浓度的去端肽胶原 (Atelocollagen)作为支架材料对人髓核细胞进行三维培养，发现低浓度去端肽胶原组细胞DNA合成及产物较高浓度偏好，虽然海藻酸钠组细胞的硫酸化糖胺多糖含量超过去端肽胶原组，但对髓核细胞进行生化分析后表明，相对于海藻酸钠组，去端肽胶原组椎间盘细胞产生更多的蛋白聚糖，而且在细胞增殖方面优势更为明显，其所产生的髓核样组织有良好的含水性，并产生更多的蛋白聚糖。目前在临床上已经验证去端肽胶原用于植入人体是一个相对安全的材料。

2.2 藻酸盐

藻酸盐主要是从海洋褐藻类生物中提取的一种线型阴离子天然多糖，是由右旋甘露醇糖醛酸残基和左旋古洛糖酸残基以均聚物和杂聚物排列方式形成的共聚物。它其中的均聚物部分遇到钙离子后可通过离子交联产生凝胶化形成网状藻酸钙离子水凝胶，进而在低浓度的钙离子溶液中(毫摩尔级浓度)可以形成热稳定凝胶。Wiltsey等[27]用藻酸盐凝胶材料对兔髓核细胞和纤维环细胞进行体外培养后发现，加入成骨蛋白-1后蛋白聚糖含量恢复加快，可刺激细胞外基质的形成，并且有利于保证机械强度。Bron等[28]用藻酸盐胶珠对兔髓核细胞和纤维环细胞进行培养，并施以低强度超声刺激，发现两种细胞在刺激下增殖变快，蛋白聚糖产生增多。Chou等[29]用光交联型藻酸盐水凝胶和离子交联型藻酸盐水凝胶对牛尾骨椎间盘髓核细胞进行培养8周后发现，虽然随着时间的推移在一定程度上失去结构的完整性，但光交联型相对于离子交联型藻酸盐水凝胶在细胞增殖、细胞活力及细胞外基质形成方面性能更优。随后 Reza等[30]进一步研究后发现光交联型藻酸盐水凝胶的内在结构特点更加有利于细胞增殖及外基质形成。

2.3 壳聚糖

壳聚糖(chitosan)是天然阳离子碱性多糖，其组织相容性与生物机械性良好，结构类似海绵状多孔结构且孔径大小相对可控，而较大的表面积也有利于细胞黏附及营养交换和细胞渗透[31]。壳聚糖生物可降解性佳，在组织工程领域应用较多，特别是在人工皮肤、骨科修复材料及手术缝线等方面应用广泛。壳聚糖的结构类似于糖胺聚糖，可被溶菌酶水解，其酶切位点位于 N-乙酰基葡萄糖胺残基。它是对甲壳素进行脱乙酰化反应生成的线性多糖，其 N-乙酰基葡萄糖胺存在于髓核细胞外基质的糖胺聚糖中，如透明质酸(髓核中的一种主要聚糖)[32]。Zhang[33]等采用壳聚糖凝胶支架材料培养髓核细胞后发现，细胞表型保持良好，同时发现大量蛋白聚糖合成并多数保留在凝胶支架内。Richardson[34]等将骨髓间充质干细胞与壳聚糖-甘油磷酸水凝胶支架材料培养4周后发现，该支架材料对于骨髓间充质干细胞向髓核样细胞分化有促进作用，骨髓间充质干细胞在该支架中有利于细胞表型分化。但壳聚糖支架的也存在一些问题，如其机械性能偏低，而且在生理环境中降解与细胞外基质合成速度不匹配，不能完全满足组织工程支架材料的需求，有待进一步优化其结构。

2.4 脂肪族聚酯均聚物

丙交酯 (LA)和乙交酯 (GA)经开环聚合后可分别制得高分子量的聚乳酸 (PLA)和聚羟基乙酸 (PGA)，它们比较容易水解，而且降解最终产物都是乳酸及羟基乙酸，是机体代谢的中间产物。聚乳酸-羟基乙酸共聚物(PLGA)是羟基乙酸和乳酸聚合而成的共聚物，同时具有两种聚酯材料的优势。常见的开环聚合是将羟基乙酸和乳酸分别脱水环化合成GA、LA两种单体，再由GA和LA开环聚合得PLGA共聚物。另一开环聚合方法是将乙醇酸和乳酸两种聚合单体制成一六元的环状交酯，再开环聚合即可得到 PLGA的交替共聚物。该共聚物组成固定且结构规整，生物相容性好，生物降解性能稳定。Yan等[35]将羊纤维环细胞接种于PGA与PLA制成的中空纤维环支架材料上，随后将羊髓核细胞以2%藻酸钠盐培养并加入硫酸钙呈凝胶状后，注入纤维环中央 (PGA/PLA支架中空处)，于体外复合培养1天后将此椎间盘复合体植入无胸腺小鼠的背部皮下，分别于4、8、12周切取标本进行检测。结果显示此种组织工程椎间盘于12周时在大体形态、生化成分和组织学特征上非常接近天然的椎间盘，细胞外基质合成随时间而增加，纤维环内I型胶原含量多而髓核内富含II型胶原。Woiciechowsky等[36]将空白的PGA透明质酸支架浸泡于同种异体血浆后，通过手术植入已切除椎间盘的兔椎间隙内，6个月后行核磁共振成像检查，发现椎间隙T2像在植入组上升45%，而在对照组则下降11%，并且影像学检查发现椎间隙高度可得到一定程度维持，椎间盘退变的进展变缓；组织学分析结果显示椎间隙中有细胞生长，组织有一定程度修复。但Cabraja等[37]通过研究发现，随着PGA/PLA支架的降解，造成了局部pH值变低即酸化，从而形成酸性环境，抑制椎间盘细胞合成硫酸化糖胺多糖等重要分子的能力。但随后他们在实验中将细胞嵌入在藻酸盐微球中，这是否会对实验产生影响有待进一步验证。

3 问题与展望

虽然目前国内外可用于组织工程支架的材料种类繁多，但对于椎间盘的支架材料方面研究则相对较浅，虽然取得了一定的进展，但仍面临诸多问题，如支架材料在与天然椎间盘的压缩性、拉伸以及黏弹特性方面差距很大；支架材料无法根据环境改变而实现自我调节，并且能否接近或者达到人体椎间盘的生物力学性能？如果接近能达到何种程度？通过组织工程在体外构建的支架材料无法模拟真正的体内微环境；对椎间盘的细胞表型研究欠缺，对许多特异性表型仍不了解，在体外无法建立表型稳定的细胞模型；如何实现在支架材料中拥有不同表型的各种细胞能够根据人体要求的比例生长增殖；如何使种子细胞与信号因子在支架材料的三维空间中实现信号与物质的交换从而发挥生物学功能等；另外目前所有的支架材料都尽可能模拟椎间盘的功能，达到一些力学及生物学指标，但这些实验都无法真正的模拟人体情况，并且针对动物实验处理的方便与易行性，目前绝大多数的体内实验都是以兔与大鼠作为实验对象，实验数据来源与人体本身就会产生差距，同时也会在进行动物实验时遗失基因的重要性，而目前认为在引起椎间盘退变的所有因素中，基因所占的比例至少在75%以上[38]。

由此可见，目前尚无公认的最佳支架材料，相关研究有待进一步深入，从而能够使支架材料在生物学性能上满足组织工程研究的需要，同时也具有与人体椎间盘组织相仿的力学性能。此外在研究过程中还存在着许多其他问题，如伦理道德及内在哲学等方面的合理性。但随着支架材料的组织工程学发展及人们对脊柱基础科学的深入研究，特别是多技术与多学科的交叉联合应用，为人类能够从生物学功能上修复与逆转退变的椎间盘，进而攻克椎间盘退变性疾病带来了极大的希望与深远的前景。

[1] Adams MA,Roughley PJ.What is intervertebral disc degeneration, and what causes it?Spine,2006,31:2151-2161

[2] Colombier P,Clouet J,Hamel O,et al.The lumbar intervertebral disc:from embryonic development to degeneration.Joint Bone Spine,2014,81(2):125-129

[3] Ogon I,Takebayashi T,Takashima H,et al.Analysis of chronic low back pain with magnetic resonance imaging T2mapping of lumbar intervertebral disc.J Orthop Sci,2015,20(2):295-301

[4] Clarke LE,Res M,Richardson SM,et al.Harnessing the Potential of Mesenchymal Stem Cells for IVD Regeneration.Curr Stem Cell Res Ther,2014,12,1.

[5] Weber KT,Jacobsen TD,Maidhof R,et al.Developments in intervertebral disc disease research:pathophysiology,mechanobiology, and therapeutics.Curr Rev Musculoskelet Med,2015,8(1):18-31

[6] Wismer N,Grad S,Fortunato G,et al.Biodegradable electrospun scaffolds for annulus fibrosus tissue engineering:effect of scaffold structure and composition on annulus fibrosus cells in vitro.Tissue Eng Part A,2014,20(3-4):672-682

[7] Foss BL,Maxwell TW,Deng Y.Chondroprotective supplementation promotes the mechanical properties of injectable scaffold for human nucleus pulposus tissue engineering.J Mech Behav Biomed Mater,2014,29:56-67

[8] Hudson KD,Alimi M,Grunert P,et al.Recent advances in biological therapies for disc degeneration:tissue engineering of the annulus fibrosus,nucleus pulposus and whole intervertebral discs. Curr Opin Biotechnol,2013,24(5):872-879.

[9] Vadalà G,Russo F,Di Martino A,et al.Intervertebral disc regeneration:from the degenerative cascade to molecular therapy and tissue engineering.J Tissue Eng Regen Med,2013,3,20.

[10]Yeung CW,Li YY,et al.Effects of nucleus pulposus cell-derived acellular matrix on the differentiation of mesenchymal stem cells. Biomaterials,2013,34(16):3948-3961.

[11]Yang X,Li X.Nucleus pulposus tissue engineering:abrief review. Eur Spine J,2009,18(11):1564-1572.

[12]Cho H,Park SH,Park K,et al.Construction of a tissue-engineered annulus fibrosus.Artif Organs,2013,37(7):131-138.

[13]Bhattacharjee M,Miot S,Gorecka A,et al.Oriented lamellar silk fibrous scaffolds to drive cartilage matrix orientation:towards annulus fibrosus tissue engineering.Acta Biomater,2012,8(9):3313-3325.

[14]Park SH,Gil ES,Cho H,et al.Intervertebral disk tissue engineering using biphasic silk composite scaffolds.Tissue Eng Part A,2012,18 (5-6):447-458

[15]Halloran DO,Grad S,Stoddart M,et al.An injectable cross-linked scaffold for nucleus pulposus regeneration.Biomaterials,2008,29 (4):438-447

[16]Lu ZF,Zandieh Doulabi B,Wuisman PI.Differentiation of adipose stem cells by nucleus pulposus cells:configuration effect.Biochem Biophys Res Commun,2007,359(4):991-996

[17]Tan JY,Chua CK,Leong KF,et al.Esophageal tissue engineering: an in-depth review on scaffold design.Biotechnol Bioeng,2012, 109(1):1-15.

[18]BP Chan,KW Leong.Scaffolding in tissue engineering:general approaches and tissue-specific considerations.Eur Spine J,2008, 12,17(Suppl4):467-479

[19]Gou S,Oxentenko SC,Eldrige JS,et al.Stem cell therapy for intervertebral disk regeneration.Am J Phys Med Rehabil,2014,93 (11 Suppl3):122-131.

[20]Wilusz RE,Sanchez-Adams J,Guilak F.The structure and function of the pericellular matrix of articular cartilage.Matrix Biol, 2014,39:25-32.

[21]Richardson SM,Hoyland JA,Mobasheri R,et al.Mesenchymal stem cells in regenerative medicine:opportunities and challenges for articular cartilage and intervertebral disc tissue engineering.J Cell Physiol,2010,222(1):23-32

[22]Tegeder I1,Lòtsch J.Current evidence for a modulation of low back pain by human genetic variants.J Cell Mol Med,2009,13 (8B):1605-1619.

[23]Halloran DO,Grad S,Stoddart M,et al.An injectable cross-linked scaffold for nucleus pulposus regeneration.Biomaterials,2008,29 (4):438-447

[24]Bara JJ,Richards RG,Alini M,et al.Concise review:Bone marrow-derived mesenchymal stem cells change phenotype following in vitro culture:implications for basic research and the clinic. Stem Cells,2014,32(7):1713-1723.

[25]Huang B,Li CQ,Zhou Y,et al.Collagen II/hyaluronan/chondroitin-6-sulfate tri-copolymer scaffold for nucleus pulposus tissue engineering. Biomed Mater Res B Appl Biomater,2010,92(2):322-331

[26]SakaiD,Andersson GB.Stem cell therapy for intervertebral disc regeneration:obstaclesand solutions.NatRev Rheumatol,2015,24.

[27]Wiltsey C,Christiani T,Williams J,Thermogelling bioadhesive scaffolds for intervertebral disk tissue engineering:Preliminary in vitro comparison of aldehyde-based versus alginate microparticlemediated adhesion.Acta Biomater,2015,16:71-80.

[28]Bron JL,Vonk LA,Smit TH,et al.Engineering alginate for intervertebral disc repair.J Mech Behav Biomed Mater,2011,4(7): 1196-1205.

[29]Chou AI,Nicoll SB.Characterization of photocrosslinked alginate hydrogels for nucleus pulposus cell encapsulation.Biomed Mater Res A,2009,91:187-194

[30]Reza AT,Nicoll SB.Characterization of novel photocrosslinked carboxymethylcellulose hydrogels for encapsulation of nucleus pulposus cells.Acta Biomater,2010,6(1):179-186

[31]Naqvi SM,Buckley CT.Differential response of encapsulated nucleus pulposus and bone marrow stem cells in isolation and coculture in alginate and chitosan hydrogels.Tissue Eng Part A,2015,21 (1-2):288-99.

[32]Anderson DG,Risbud MV,Shapiro IM,et al.Cell-based therapy for disc repair.Spine,2005,5:297-303

[33]Zhang Z,Li F,Tian H,et al.Differentiation of adipose-derivedstem cells toward nucleus pulposus-like cells induced by hypoxia and a three-dimensional chitosan-alginate gel scaffold in vitro. Chin Med J(Engl),2014,127(2):314-321.

[34]Richardson SM,Hughes N,Hunt JA,et al.Human mesenchymal stem cell differentiation to NP-like cells in chitosan-glycerophosphate hydrogels.Biomaterials,2008,29:85-93

[35]Yan J,Yang S,Sun H,et al.Effects of releasing recombinant human grow th and differentiation factor-5 from poly(lactic-co-glycolic acid)microspheres for repair of the rat degenerated intervertebral disc.J Biomater Appl,2013,10,29(1):72-80.

[36]Woiciechowsky C,Abbushi A,Zenclussen ML,et al.Regeneration of nucleus pulposus tissue in an ovine intervertebral disc degeneration model by cell-free resorbable polymer scaffolds.J Tissue Eng Regen Med,2014,8(10):811-20.

[37]Cabraja M,Endres M,Hegewald AA,et al.A 3D environment for anulus fibrosus regeneration.J Neurosurg Spine,2012,17(2):177-183.

[38]Battie MC,Videman T,Parent E.Lumbar disc degeneration:epidemiology and genetic influences.Spine,2004,29:2679-2690.

Progress in scaffold materials of intervertebral disk tissue engineering

Morigele,Wang Yuewen.Department of Orthopedics,the Affiliated Hospital of Inner Mongolia Medical University, Huhhot Inner Mongolia,010050,China

Intervertebral disc degeneration caused by neck and back pain is one of the most common clinical disease, and whether the current surgical and non-surgical treatment were unable to achieve satisfactory results.In recent years, along with the study of intervertebral disc tissue engineering technology deepening,the treatment of degenerative disc degeneration also has a new direction.In the disc tissue engineering,and how to build the seed cells for carrying scaffold is one of the difficulties.In this paper,we narrate collagen,alginate,chitosan and aliphatic polyester homopolymers and other cross-sectional of the intervertebral disc tissue engineering study of the scaffold into a brief overview.

Intervertebral disc, Tissue engineering, Scaffold

R318

A

莫日格乐(1979-)男，博士，主治医师。工作方向:骨外科。

*[通讯作者]王跃文(1962-)男，学士，主任医师。工作方向:骨关节，骨肿瘤。

2015-01-12)

10.3969/j.issn.1672-5972.2015.02.017

swgk2015-01-0003

内蒙古医科大学附属医院骨外科，内蒙古呼和浩特市010050