微生物降解原油的操作条件优化研究

田伟，朱米家，刘瑞平，武笑影，陈辉伦，姚俊

(北京科技大学 土木与环境工程学院国家环境与能源国际联合基地，北京 100083)

随着社会经济的不断发展，原油及其衍生品的开发应用日益增加，由此造成的环境污染日趋严重。原油污染的治理成了当前亟待解决的环境问题。治理原油污染的传统物理化学方法有一定的实效，但其往往也存在费用昂贵、有二次污染等缺点。而生物修复技术由于其费用低、处理彻底以及无二次污染等优点，逐渐受到人们的关注［1］。研究表明，油田产出水中存在着一系列经自然选择优化过的混合菌群，其中不同菌株的功能通过长期的演化稳定下来，混合菌群有较好的原油降解效果［2］。

对于一个多变量系统，传统的单因素实验无法明确表达自变量与系统响应之间的关系，而且运行次数较多，效率有待提高。响应曲面法是用一系列超曲面来描述实际的复杂函数关系，是优化和评价影响反应的各个自变量水平和交互作用的最有效的方法之一，已经在系统优化设计和模型可靠性预测领域得到了广泛应用［3-9］。

研究以油田产出水中可培养的混合菌为实验菌源，以大港油田原油为降解对象，考察pH 值、接种量和盐度对原油降解率的影响，采用响应面法进行优化，得到最佳降解条件，并分析单因素及因素之间的交互作用对降解效果的影响，在最优条件下分析原油的降解情况，以期为原油污染环境修复提供一种新的方法。

1 实验部分

1.1 材料与仪器

实验所用的原油降解混合菌来自于油田产出水，产出水和原油均取自天津大港油田。样品直接从产出水井井口获得，并放置于无菌玻璃瓶中。待样品充满玻璃瓶后密封，防止氧气进入。样品在4 ℃下保存，实验中用到的其它试剂均为分析纯。

UV2450 紫外分光光度计;QP2010 型GC-MS 分析仪;HZQ-F160 全温振荡培养箱;PHS-3C 型pH 计。

1.2 接种微生物和培养基

以葡萄糖培养基对产出水活化后用于接种。好氧降解实验在装有100 mL 无机盐培养基的250 mL锥形瓶中进行，原油浓度为0.5%(w/v)。无机盐培养基配方(L－1):NaCl 0.5 g，KCl 0.4 g，KH2PO40.5 g，CaCl20.1 g，NH4Cl 0.4 g，MgCl20.4 g，微量元素溶液1 mL。微量元素溶液配方(L－1):FeCl2·4H2O 1.5 g，ZnCl 70 mg，MnCl2·4H2O 100 mg，H3BO36 mg，CoCl2·6H2O 190 mg，CuCl2·2H2O 2 mg，NiCl2·6H2O 24 mg，Na2MoOH·2H2O 36 mg和HCl(25%)10 mL。培养基在121 ℃、101 MPa 下灭菌30 min。

1.3 单因素实验

为了确定影响原油生物降解的3 个因素(盐度、接种量、pH)的优化范围，进行单因素实验。将OD600=0.5 ～0.6 的菌悬液接种到以原油为唯一碳源的无机盐培养基，设置不同的变量水平，在30 ℃和180 r/min 下振荡培养。3 个影响因素的不同水平设置如下:盐度(w/v 0，0.5%，1%，2%，5%)，接种量(v/v 3%，5%，7%，9%，11%，13%)和pH 值(5，6，7，8，9，10)。每组实验设置3 组平行，同时以不接种的培养体系作为对照。

紫外分光光度计测得实验用原油在227 nm 处具有特征吸收峰。培养10 d 后，用二氯甲烷萃取培养基中剩余的原油，通过原油降解率来评价3 种因素对原油降解的影响。测定萃取液(经稀释)在波长227 nm 处的吸光度A，然后根据A 与油浓度C 的标准曲线计算出含油量C，并计算出原油降解率G(%)［10］。其中，原油降解率G 按照下式计算:

其中，C0、C 分别为实验开始和结束时的原油浓度。通过计算得到原油的萃取回收率为(95.2 ±3.12)%，基本满足测定要求。

1.4 实验设计和数据分析

所使用的Box-Behnken 设计方法包括3 个独立变量，即盐度、接种量、pH 值。每一个变量有3 个水平(－1，0，1)。经过10 d 培养后测定原油降解率。实验设计的编码值和实际值见表1。用统计软件Design-Expert 7.1.5 分析拟合方程中每一项的显著性和评估每种情况的拟合度。

表1 Box-Behnken 因素水平设计Table 1 Levels and factors in Box-Behnken experimental design

1.5 优化条件下原油降解实验

在最优条件下进行好氧原油降解实验，培养体系和条件同1.2 和1.3 节。培养10 d 后萃取剩余原油，测定原油降解率，验证RSM 的实用性，并用GC-MS 方法分析剩余原油组分，以不接种的培养体系作为空白对照。

2 结果与讨论

2.1 单因素实验

3 个变量对原油降解的影响见图1。

由图1a 可知，随着盐度的增加，原油降解率呈现先增大后减小的趋势。盐度是一个较复杂的影响因素，适宜的盐度在微生物生长过程中起着促进酶反应、维持膜平衡、调节渗透压和控制细胞的氧化还原电位等重要作用。盐度过高会对普通微生物的生长产生毒性，降低微生物呼吸速率，使酶活性受阻［11］。一些研究表明，盐分通过影响微生物的代谢活性来影响原油的降解效果［12］。

另外，研究者发现接种量也是限制原油降解效果的因素之一，通过影响微生物的延迟期来影响微生物对原油的降解效率。当接种量很小时，微生物的延迟期长，原油降解的启动时间延后，不利于原油降解，反之调整期较短，同时，又会引起营养物质的竞争，导致单个菌体得不到足够的营养物质，同样不利于原油降解［13-14］，这与图1b 得到的结论是一致的。由于在微生物的生长过程中，其体内发生的是酶促反应，而对于酵促反应都有一个最适合的pH范围，故pH 是影响微生物生长繁殖的一个重要因素。

由图1c 可知，在pH 值为8 时，原油降解率最高，达到了41.8%。pH 主要通过影响微生物细胞电荷的变化、代谢过程中酶的活性以及细胞质膜透性和稳定性来影响微生物对营养物质的吸收，进而影响原油的降解效率［15］。微生物的生命活动、物质代谢与pH 值有密切的关系［16-17］。

图1 盐度(a)，接种量(b)和pH(c)对微生物降解原油的影响Fig.1 Salinity (a)，inoculum concentration (b)and pH value(c)effects on the degradation of crude oil by microorganisms

2.2 优化原油降解的响应面分析(RSM)

根据前期的单因素实验可知，适宜的反应条件为盐度0.5% ～2%，接种量5% ～9%，pH 值7 ～9。本实验设计了3 因素3 水平共15 个实验点的实验方案，其结果见表2。通过软件对表2 中的数据进行多元回归拟合，得到二元多项式回归方程:

由表3 回归方程的方差分析(ANOVA)可知，该模型显著性高，X1、X2、X12、X22和X32的Prob ＞F 值均小于0.05，说明其是显著性影响因素。该模型中混合菌的投加量对原油降解的影响最大，其次是盐度。另外，表3 中显示模型的失拟项不显著(P =0.175 1 ＞0.05)，说明回归方程描述各变量与响应值之间的非线性方程关系是显著的，也就是说明这种实验方案是可靠的。

表2 响应面运行数据Table 2 The operation data of response surface methodology

图2 实际值与预测值的线性关系Fig.2 Linear relationship between actual value and predicted value

根据图2，模型预测值与真实值线性相关系数R2= 0.970 1，说明该模型能解释97.01% 响应值的变化，即该模型与实际实验拟合良好，－=0.970 1－0.916 2 = 0.053 9 ＜0.2;CV=8.27% ＜10%，表明模型的可信度与精密度高。总之，在该研究区域内回归方程能够很好地模拟真实的曲面，模型的精密度和可信度均在可行的范围内，因此可用该模型对混合菌降解原油的优化实验条件进行分析和预测。经过优化后，得到操作条件盐度0.83%，接种量6.16% 以及pH 7.84，预测最高降解率为44.65%，按此条件所得实际降解率为45.24%。

表3 回归方程的方差分析Table 3 ANOVA table for obtained experimental responses

2.3 交互作用

表示变量交互影响的响应面三维图，见图3。

从图3 中反映的等高线可以看出，图3a 盐度保持在－ 1 水平时，随着接种量的上升，降解率从28.75%下降至10.52%;盐度在+1 水平时，随着接种量的增加，降解效果从32.15%下降至2.28%，这说明两种效应叠加，使下降幅度更显著。图3b 反映了在盐度为－1 水平时，随着pH 值上升，降解率从24.72%下降至23.25%;盐度保持在+1 水平时，原油降解从10.03%下降至9.65%。图3c 显示当pH值为－ 1 水平时，随着接种量的上升，降解率从35.2%下降至5.11%;pH 值为+1 水平时，随着接种量的上升，降解率从24.17%下降至7.24%。据相关文献报道，pH 值对微生物生命活动的影响主要有:一是引起细胞内大分子蛋白质、核酸电荷的变化从而导致细胞活性变化;二是pH 值过高会在一定程度上限制降解菌的生长和降解酶的分泌及其活性，而pH 值过低时，氢离子浓度超过微生物酶的适应范围，同时又改变了微生物原生质膜的电荷，从而改变微生物吸收营养物质的能力;三是改变营养物质的可给性和危害物质的毒性［18］。

2.4 优化条件下原油微生物降解分析

通过在最优条件下用微生物降解原油来验证优化结果，即在盐度为0.83%，接种量为6.16%，pH为7.84 的条件下好氧培养10 d，原油降解率为45.24%。

图3 表示变量交互影响的响应面三维图Fig.3 Response surface 3D plots indicating interaction effects

优化条件下微生物降解原油的总离子色谱图如图4 所示。图4 展示的是培养0，10 d 和对照组的原油的总离子色谱图。对比对照组和0 d 的谱图，可以发现对照组原油中轻质原油组分有一定的缺失，这可能是由于部分原油烃的挥发造成的，从10 d的谱图可以看出，实验结束时微生物对原油有明显的降解作用。分析图谱可知，在10 d 的时间内，大部分的正构烷烃被降解了，降解率高达97%，部分长链的正构烷烃(C33-C36)也有很好的降解。为了考察降解过程中多环芳烃的变化，选取了8 种2 环-4 环的多环芳烃，可以得出轻质的多环芳烃的降解比较完全，因为它们的易挥发特性，而其他3-4 环的多环芳烃的降解率达到了89.03%，所选多环芳烃总降解率达到了91.48%。由此可知，在最优条件下，原油降解菌可以在较短的时间内对原油中的正构烷烃和多环芳烃组分的降解有较好效果。

图4 不同培养时期原油的总离子色谱图Fig.4 Total ion chromatogram of crude oil of different incubation times

3 结论

从原油产出水中筛选出原油降解混合菌，将其接种于原油无机盐培养基中培养。通过单因素实验，确定了微生物降解原油过程中的3 个影响因素盐度、pH 和接种量的优化范围。进而通过响应面分析法确定了最优条件:盐度0.83%、接种量6.16%和pH 值7.84，经过实验验证，与预测值接近。用GC-MS 方法分析原油生物降解过程中主要组分的变化，发现在10 d 的时间内，原油中的正构烷烃组分几乎被完全降解，对所选取的多环芳烃组分也有较高的去除率，达到了91.48%。这表明经过培养条件的优化，油田产出水中微生物可以用于原油污染的修复。

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