广州管圆线虫幼虫死活快速鉴别的实验研究

徐娜++杨毅梅

摘要：目的 寻找快速鉴别广州管圆线虫死活的染色方法。方法 用中性红、台盼蓝和美蓝三种染液对活或死广州管圆线虫幼虫进行染色。结果 中性红染液和美蓝染液可以使死亡的广州管圆线虫幼虫染色，活虫不染色且活力不受染色剂影响；台盼蓝染液对广州管圆线虫死、活幼虫均不染色。结论 中性红和美蓝染液可快速鉴别广州管圆线虫幼虫的死活。

关键词：广州管圆线虫；幼虫；中性红；台盼蓝；美蓝

Experimental Study on Determination of Viability of the Larvae of Angiostrongylus Cantonensis

XU Na，YANG Yi-mei

（Basic Medical College of Dali University，Dali 671000，Yunnan，China）

Abstract：Objective To exploretheprompt methods indeterminationof viabilityof the larvae of Angiostrongylus cantonensis. Methods The larvae of Angiostrongylus cantonensis larvae were stained with neutral red、trypan blue or methylene blue. Results The dead Angiostrongylus cantonensis larvae were observed when stained with neutral red 、methylene blue.The vital larvae were unstained with all three stains.Trypan blue do not staind the larvae neither live or dead.Conclusion Both neutral red and methylene blue staining are prompt method in determination of viability of the larvae of Angiostrongylus cantonensis.

Key words：Angiostrongylus cantonensis；Larvae；Neutral red；Trypan blue；Methylene blue

广州管圆线虫病是一种食源性寄生虫病，主要是由于生食或半生食含有广州管圆线虫三期幼虫的螺蛳或被其污染的蔬菜而引起致病。在筛选广州管圆线虫的杀虫药物时，常需要迅速而便捷的判断广州管圆线虫的生命状态。据有研究者报道，用染料对虫体进行染色可以判断虫体的死活[1]，但用于判断广州管圆线虫幼虫死活的染色方法却尚未见报道。本试验通过比较3种染色方法，寻找快速鉴别广州管圆线虫幼虫死活的染色方法。

1资料与方法

1.1一般资料 ①中性红染液：用ph为7.4的PBS缓冲液配制，浓度为0.1%。②台盼蓝染液：用ph为7.4的PBS缓冲液配制，浓度为0.4%。③美蓝染液：用95%酒精配制，浓度为1.4%。④广州管圆线虫幼虫：从本实验室保种福寿螺体内获得。

1.2方法

1.2.1广州管圆线虫幼虫的获取

1.2.1.1活虫的获取 取本实验室保种福寿螺去壳剁碎后放入盐酸胃蛋白酶消化液中消化中8h，分别用80目和160目筛子对消化液进行过滤，取剩余消化液沉淀2h后的沉渣，加适量生理盐水稀释，即获得活性良好广州管圆线虫幼虫的混悬液。

1.2.1.2 死虫的获取 吸取活幼虫沉渣2ml放入离心管，加入2ml生理盐水，在盛水烧杯中煮沸（95℃）1min。

1.2.2 染色方法

1.2.2.1 活虫染色 ①中性红染色：取活广州管圆线虫幼虫混悬液四滴和一滴染液于载玻片上混匀，随后加盖玻片放入显微镜下观察1h。②台盼蓝染色：取活广州管圆线虫幼虫混悬液九和一滴染液于载玻片上混匀，随后加盖玻片放入显微镜下观察1h。③美蓝染色：取活广州管圆线虫幼虫混悬液九和一滴染液于载玻片上混匀，随后加盖玻片放入显微镜下观察1h。

1.2.2.2死虫染色 死虫染色方法同活虫染色方法。

2结果

2.1用0.1%中性红、0.4%台盼蓝和1.4%美蓝三种染液鉴别广州管圆线虫幼虫死活结果见表1。死亡幼虫可被0.1%中性红染料染成红色或被1.4%美蓝染料染成蓝色，但不能被0.4%台盼蓝染色；活的广州管圆线虫幼虫均不能被这三种染料染色。

2.2从染色时间上来看，美蓝染液可以迅速的使死幼虫着；中性红使虫体的着色速度相对较慢：1min可使大部分死亡幼虫染色，6min可使全部虫体染色但染色成都不均，15min可使全部虫体均匀的染成深红色。因而，在染色时间上看，美蓝染液的效率更高。

3讨论

广州管圆线虫病是近年来多发的人兽共患寄生虫病，严重时可以导致患者死亡，控制传染源，选择有效的杀虫药物是防治该病的重要环节。在筛选杀虫药物时，往往是通过虫体是否死亡来判断其药效，因而简便、快速、准确的判断虫体死活是进行相应研究的前体。而用染色法观察广州管圆线虫幼虫的死活，尚未见报道，而染色法来判断旋毛虫、秀丽隐杆线虫、弓形虫方面的研究已经屡见报道。本次实验结果显示中性红与美蓝染液染色，都能较好的检测广州管圆线虫的死活，实验室可任选一种。

广州管圆线虫死幼虫能被中性红和美蓝染液染成红色或蓝色，两种染液对活幼虫却均不着色。在显微镜下幼虫的死活极易观察辨认，操作简单，不需要特殊设备，且可靠性强。因而考虑可以将次判断幼虫死活的方法进行推广。

参考文献：

[1]万树青.杀线虫剂活性测定中线虫死活鉴别的染色方法[J].植物保护，1993（3）：37.

[2]高学娟，尹文彦，陆娟，等.染色法鉴别秀丽隐杆线虫生命状态探究[J].广东农业科学，2010，9：189-195.

[3]王小莉，李亮，方强，等.染色法鉴别旋毛形线虫成虫死活的实验观察[J].蚌埠医学院学报，2011，10，（10）：1041-1046.

[4]沈玉娟，常正山，张永年.旋毛虫死活快速鉴别的实验研究[J].中国兽医寄生虫病，2003，10（4）：21-22.

[5]谢霖崇，傅玉才，金立群，等.弓形虫速殖子死活快速鉴别的实验研究[J].中国热带医学2009，9，（10）：2057-2071.编辑/孙杰