发光生物在污染水体中的生长试验分析

张文华

(包头轻工职业技术学院生物工程学院，内蒙古包头 014035 )



发光生物在污染水体中的生长试验分析

张文华

(包头轻工职业技术学院生物工程学院，内蒙古包头 014035 )

以培养时间为横坐标，吸光度为纵坐标，通过发光生物在污染水体中的生长试验，绘制污染水体中哈维氏弧菌、费氏弧菌、火神弧菌、明亮发光菌杆菌以及发光异短杆菌的生长曲线。确定发光生物在污染水质中的培养条件，为发光生物的生长条件提供可靠的依据。结果表明，发光生物的生长和污染水体具有很大的相关性，污染程度越大，发光生物生长越迅速。

发光生物；污染水体；生长曲线

随着工业农业的不断发展，当今世界面临日益严重的环境污染问题，水污染尤其突出[1-2]。水中污染物种种类繁多，性质复杂，且污染物之间可发生协同、相加或者拮抗等复杂问题。尤其发光生物种类更多，发光生物因其独特的生理特性，与现代光电检测手段结合具有快速、灵敏、简便等特点，所以分析发光生物在污染水体中的生长曲线，不仅能够很好地体现出这些发光生物在不同生长阶段的生长特性，还能通过发光生物的生长来预测水体的污染[3-5]。

典型的发光生物在污染水体中的生长曲线主要包括调整期、对数生长期、稳定生长期、衰亡期。现阶段，对于发光生物的生长和各阶段的生长曲线方程大都只考虑某一阶段。针对上述问题，笔者给出适用于对数增长期和稳定增长期的公式，然后依据该公式绘制发光生物在污染水体中的生长进行试验，通过测定发光生物吸光度值的变化，绘制最佳生长曲线，从而更准确地描述水质污染的程度。

1 发光生物在污染水体中的生长曲线方程

假设发光生物在污染水体中的初始态充分适应环境的改变，无需消耗时间去调整；试验在理想的静止状态下进行，温度、pH、OD值(吸光度值)等全部是常量；试验在一个封闭的空间下进行，与外部环境无能量交换。发光生物在污染水体中的消亡和增殖过程是同时进行的，总体来看，从初始阶段到稳定增长阶段是一个不断增长的过程，发光生物净增殖需分析细胞合成和内源代谢，所以发光生物的净增殖同样是通过细胞的增殖与消亡合并而成的。发光生物的净增殖速率为：

(1)

由发光生物反应动力学可知：

(2)

把公式(2)代入公式(1)，则有：

(3)

假设K1=YK-Kd，K2=KdKS，那么可将公式(3)简化为：

(4)

根据泰勒公式可得：

(5)

由于要求计算精度，所以只取到二次项，即：

(6)

(7)

(8)

同理可得：

(9)

(10)

在实际应用中，通过以上过程即可完成对发光生物在污染水体中生长曲线的设定。

2 发光生物在污染水体中的生长试验

2.1 试验材料及仪器 试验用水为某市不同路段不同污染程度的污染水体。试验仪器为DHP系列生化培养箱，由上海精密仪器仪表有限公司生产；SPX-150型智能生化培养箱，由上海百典仪器设备有限公司生产；SW-CJ系列超净工作台，由上海新苗器械制造有限公司生产；722N型可见分光度计，由上海菁华科技仪器有限公司生产； GUJS行发酵罐，由镇江东方生物工程设备技术有限责任公司生产。

2.2 试验设计

2.2.1 培养基。麦芽汁液体培养基组成：麦芽汁70 ml、琼脂15 g、氯霉素0.1 g、麦芽高粉130 g。MRS液体培养基组成：蛋白胨20.00 g、牛肉膏粉10.00 g、酵母膏粉8.00 g、葡萄糖40.00 g、吐温401 ml、磷酸二氢钾4.00 g、乙酸钠10.00 g、柠檬酸三铵2.00 g、硫酸镁(MgSO4·H2O)0.20 g、硫酸锰(MnSO4·4H2O)0.05 g、蒸馏水1 000 ml。配制好的培养基在121 ℃下灭菌20 min后待用。

2.2.2 培养液预处理与菌种活化培养。取1 g样品放在装有100 ml无菌水的三角瓶中，200 r/min转速下振荡30 min后放置直至澄清。采集1 ml菌悬液对其进行系列稀释。将合适梯度的稀释液依次涂布在麦芽汁液体培养基与MRS液体培养基平板上，各样品平行涂布2块。然后，依据各种微生物适合生长的温度，将其放置在生化培养箱中完成培养，最后筛选出细菌，主要包括哈维氏弧菌、费氏弧菌、火神弧菌、明亮发光菌杆菌以及发光异短杆菌。

2.2.3 菌种生长曲线测定。以哈维氏弧菌为例，首先将722N型分光光度计预热30 min，以未接种的哈维氏弧菌培养液对比色计的零点进行校正。将培养后的细菌放入污染水体中，每隔2 h取哈维氏弧菌培养液5 ml，对其OD值进行检测。以培养时间为横坐标，吸光度为纵坐标，绘制哈维氏弧菌的最佳生长曲线。

3 结果与分析

3.1 哈维氏弧菌的生长曲线 由图1a可知，在37 ℃下哈维氏弧菌的生长曲线中，0～9 h是延滞期，10～22 h是对数期，23～42 h是稳定期。哈维氏弧菌的延滞期与对数期均为10 h左右，说明哈维氏弧菌生长缓慢，这也许是由于哈维氏弧菌培养的适宜温度为40 ℃左右，但该试验的培养温度是37 ℃，相对较低的温度使得乳酸菌的生长速度有所减慢，需将其放置在40 ℃生化培养箱中进行培养。由图1b可知，在40 ℃下哈维氏弧菌的生长曲线中，0～6 h是延滞期，7～14 h是对数期，15～34 h是稳定期。哈维氏弧菌稳定期持续时间相对较长，达19 h，有利于乳酸菌积累次级代谢产物，后者更适合哈维氏弧菌的生长，而表现出污染水体的污染程度较大。

注：a.37 ℃;b.40 ℃。图1 不同温度下哈维氏弧菌的生长曲线

3.2 费氏弧菌的生长曲线 先将费氏弧菌放置在23 ℃的生化培养箱中进行培养，培养后再放入污染水体中。由图2可知，在费氏弧菌的生长曲线中，延滞期是0～7 h，对数期是8～14 h，稳定期是16～34 h。稳定期相对较长，持续了18 h，有助于费氏弧菌的发酵，使其充分积累代谢产物。所以该试验条件很适合费氏弧菌的生长，说明水体污染能够促进费氏弧菌的生长。

图2 费氏弧菌的生长曲线

3.3 火神弧菌的生长曲线 由图3可知，火神弧菌生长迅速，几乎观察不到其延滞期，很快进入对数期(2～11 h)，培养11 h后进入稳定期(12～30 h)。其稳定期持续18 h，为火神弧菌积累次级代谢产物提供了足够的时间。该试验将火神弧菌放置在32 ℃的生化培养箱中进行培养，证明火神弧菌的生长也能体现污染水体的影响。

图3 火神弧菌的生长曲线

3.4 明亮发光菌杆菌的生长曲线 将明亮发光菌杆菌放置在37 ℃生化培养箱中培养，然后放入污染水体中。由图4可知，明亮发光菌杆菌的生长速度较慢，延滞期为11 h，对数期为12～20 h，而稳定期为21～36 h，持续15 h。

图4 明亮发光菌杆菌的生长曲线

3.5 光异短杆菌的生长曲线 光异短杆菌培养过程中所采用的温度为37 ℃。由图5可知，光异短杆菌的生长速度较

图5 光异短杆菌的生长曲线

快，0～4 h是延滞期，5～11 h是对数期，12～30 h是稳定期。污染水体保证了18 h的稳定期，该污染水体环境能够满足光异短杆菌的生长。

4 结论

微生物由于生长迅速、繁殖周期短、运转费用低，故以其作为对象来评价水质的研究极为广泛。传统方法对发光生物的生长试验，不能对发光生物的数量进行准确测量，误差较大。提出以培养时间为横坐标，吸光度为纵坐标，通过发光生物在污染水体中的生长试验，绘制污染水体中的哈维氏弧菌、费氏弧菌、火神弧菌、明亮发光菌杆菌以及发光异短杆菌的生长曲线。确定发光生物在污染水体中的培养条件，为发光生物的生长条件提供可靠的依据。结果表明，在40 ℃环境下哈维氏弧菌的生长曲线中，哈维氏弧菌的延滞期为6 h，对数期为7 h，稳定期为19 h，有利于哈维氏弧菌次级代谢产物的积累；在23 ℃的环境下，费氏弧菌生长曲线的延滞后期为7 h，对数期为6 h，稳定期为18 h，有助于费氏弧菌的发酵；在32 ℃的环境下，火神弧菌生长迅速，几乎观察不到其延滞期，对数期为9 h，稳定期持续18 h，适合火神弧菌生长；在37 ℃环境下，明亮发光菌杆菌的生长速度较慢，延滞期为11 h，对数期为8 h，稳定期为15 h。

[1] 荣瑞金，李祖明，王德良，等.中国酒曲微生物研究进展[J].中国酿造，2009(6)：5-8.

[2] 蒲岚，李璐，谢善慈，等.浓香型白酒窖池中糟醅微生物的变化趋势研究[J].酿酒科技，2011(1)：17-19.

[3] 罗惠波，黄治国，李浩，等.浓香型大曲真核微生物群落的PCR-SS-CP解析[J].中国酿造，2009(8)：42-45.

[4] 白凤玲.预测微生物学在传统白酒酿造中的应用构想[J].酿酒科技，2006，145(7)：31-33.

[5] 孙斌.微生物生长曲线方程讨论[J].辽阳石油化工高等专科学校学报, 2002(3): 7-9.

The Growth Experiment of Luminous Organism in Contaminated Water

ZHANG Wen-hua

(Institute of Biological Engineering, Baotou Light Industry Vocational and Technical College, Baotou, Mongolia 014035)

With the training time as abscissa, absorbance as ordinate, through experiment of luminous organism in contaminated water, the growth curves ofVibrioharveyi,Vibriofischeri,Vibriologei,LuminescentbacteriumBacillus were drawn. The culture conditions for luminous organism in contaminated water was determined, which will provide reliable basis for growth conditions of luminous organism. The results showed that the growth of luminous organism is significantly correlated with contaminated water.

Luminous organism; Water contamination; Growth curve

张文华(1974- )，女，蒙族，内蒙古通辽人，讲师，硕士，从事微生物技术及应用研究。

2015-04-20

S 181

A

0517-6611(2015)17-282-03