重楼愈伤组织的抑菌作用研究

刘银花，王跃华，何新友，陈 燕，唐 旭，梅 英，黄 鹏

(1.四川师范大学生命科学学院，四川 成都 610101;2.成都大学生物工程学院，四川 成都 610106;3.四川金土地中药材种植集团有限公司，四川 成都 611130)

重楼愈伤组织的抑菌作用研究

刘银花1，2，王跃华2，何新友3，陈 燕3，唐 旭1，2，梅 英2，黄 鹏2

(1.四川师范大学生命科学学院，四川 成都 610101;2.成都大学生物工程学院，四川 成都 610106;3.四川金土地中药材种植集团有限公司，四川 成都 611130)

目的:探究重楼根茎诱导获得愈伤组织的抑菌作用，为中药资源的有效开发利用提供一条重要途径.方法:以宋内氏痢疾杆菌、金黄色葡萄球菌、铜绿假单胞菌为受试菌，头孢噻肟钠为对照药，采用试管稀释法和琼脂平板扩散法对重楼根茎愈伤组织提取物的抑菌作用进行研究，并比较它们的最小抑菌浓度.结果:重楼根茎愈伤组织提取物对宋内氏痢疾杆菌、金黄色葡萄球菌、铜绿假单胞菌的最小抑菌浓度分别为15.63 mg/mL、31.25 mg/mL、31.25 mg/mL.结论:重楼根茎愈伤组织提取物具有一定的抑菌作用，为其临床应用提供了实验依据.

重楼;愈伤组织;抑菌

0 引言

药用植物重楼，为百合科植物云南重楼和七叶一枝花的干燥根茎.目前，重楼属全球共有24种，分布于欧亚大陆的热带及温带地区，我国种类最多，有19种，全国都有分布，尤以西南各省区种类和资源最为丰富［1］.

重楼根茎部位含有重楼皂苷等成分，其具有抗肿瘤、止血、抗菌、消炎、镇痛、镇静、免疫调节、抗氧化及保护肝脏与肾脏等功效［2］.研究发现，滇重楼对金黄色葡萄球菌、普通变形杆菌、铜绿假单胞菌等8种能引起疖、痈、刨伤感染、溃疡的细菌具有很好的抑菌作用［3］.同时，重楼也是多种中成药的重要成分，制药工业对重楼的需求量逐年递增，以致供不应求.巨大的需求缺口驱动商品药材价格飞涨，导致乱采滥挖的现象屡禁不止，使得道地产区野生重楼资源严重枯竭濒临灭绝.植物组织培养技术是一种可以使重楼快速繁育的有效途径之一，通过组织培养技术快速获得大量愈伤组织，可在一定程度上解决重楼药材供不应求的局面.本研究为了探讨重楼根茎诱导获得的愈伤组织是否同重楼根茎药材一样具有很好的抑菌作用，采用重楼根茎为外植体来诱导产生愈伤组织，并进一步分析了愈伤组织提取物对宋内氏痢疾杆菌、金黄色葡萄球菌、铜绿假单胞菌3种细菌的抑菌作用，以期为中药资源的有效开发利用提供一条重要途径.

1 材料

实验所用的重楼植物采集自四川省都江堰市，实验时，选取生长健康、无病虫害的重楼植物根茎为外植体诱导获得愈伤组织.实验菌种由成都大学生物产业学院微生物实验室提供.

2 方法

2.1 愈伤组织诱导

选取生长健康、无病虫害的重楼植物的根茎，先用流水洗净泥土后吸干表面的水分，然后切除根茎上的不定根，再在超净工作台上切取根茎前端带芽体部分的第1个茎节，先用0.1%升汞消毒9 min，然后用无菌水冲洗5次，切除根茎上的芽体，最后将该根茎茎节切成1.0 cm3大小后接入MS+6-BA 1.0 mg·L－1+NAA 1.5 mg·L－1+2，4-D 1.5 mg·L－1的愈伤组织诱导培养基中，将其置于6℃的冰箱中低温处理15 d，再转放在培养温度为22℃、每天光照6 h、光照强度为1 000 lx的条件下培养55 d［4］.

2.2 重楼根茎愈伤组织提取物的制备

取诱导获得的重楼愈伤组织，自然干燥后置于60℃烘箱中烘至恒重，研成细粉后放置于干燥器中备用.称取愈伤组织粉末100 g加入无水甲醇溶液2 500 mL，不断搅拌下浸提24 h.重复3次，合并滤液，并在真空负压条件下，加热浓缩成浸膏，所得浸膏为5.0 g，然后加入蒸馏水10 mL使浸膏溶解，配置成浓度为500 mg/mL的药液.静置，置冰箱备用.

2.3 牛肉膏蛋白胨培养基的配置

称取牛肉膏5 g，蛋白胨10 g，氯化钠5 g，琼脂20 g，加入蒸馏水定容至1 L，微温溶解后调节pH值为7.0～7.2，煮沸，贮存于锥形瓶中，121℃高压灭菌20 min.另配置1 L牛肉膏蛋白胨液体培养基，即不加琼脂.

2.4 菌种活化及抑菌浓度检测

选用宋内氏痢疾杆菌、金黄色葡萄球菌、铜绿假单胞菌3种细菌为受试菌，实验菌种经传代培养后，接种于牛肉膏蛋白胨液体培养基中，置于摇床上，震荡18 h.经比浊法测定细菌数为108CFU/mL，稀释至105CFU/mL，通过倾注平板法计数.实验中，每1 mL液体培养基加入0.1 mL细菌液，37℃恒温箱培养24 h，计数菌落数乘以稀释倍数即得最终实验浓度，其中，宋内氏痢疾杆菌为3.3×105CFU/mL，金黄色葡萄球菌为2.4×105CFU/mL，铜绿假单胞菌为3.2×105CFU/mL.

2.5 试管稀释法

取具有棉塞的试管9支并灭菌，编号后排列在试管架上，于每管中先加入已灭菌的牛肉膏蛋白胨培养液2.0 mL，然后于第1管中加入灭菌的愈伤组织提取液2.0 mL，充分混匀后从中吸取2.0 mL加入第2管，同样混匀后取2.0 mL加入第3管，依此类推，直到第7管取出2 mL弃去，使成1∶2、1∶4、1∶8、1∶16、1∶32、1∶64、1∶128，各管浓度分别为250.00 mg/mL，125.00 mg/mL、62.50 mg/mL、31.25 mg/mL、15.63 mg/mL、7.82 mg/mL、3.91 mg/mL.第8管不加药物作对照，以便观察培养基是否适合细菌生长.第9管中加入愈伤组织提取液2 mL，混合均匀取出2 mL弃去，不加细菌，以便观察受试提取物是否有污染.每个稀释倍数取3份样，其中3份样的每支试管中分别加入等量的宋内氏痢疾杆菌、金黄色葡萄球菌、铜绿假单胞菌菌液各0.1 mL(菌液浓度为104CFU/mL)，将其置于恒温箱中37℃培养24 h，观察结果.若培养基混浊，表示细菌生长，若培养基完全清亮，表示无细菌生长.将未混浊管培养基转种到琼脂培养基平板上，仍无细菌生长即表示该管对应的药液浓度即为其最小抑菌浓度(Minimal inhibition concentration，MIC).

2.6 琼脂平板扩散法(打孔法)

将21个直径约90 mm，高约16～17 mm的洁净干燥并灭菌的培养皿，分为3组，每组7个.将已灭菌的牛肉膏蛋白胨培养基倒入培养皿，均匀摊布于皿中，放置在水平台上，待其凝固后作为底层，每个培养皿底层厚度约为5 mm.另取牛肉膏蛋白胨培养基并分装于3个洁净干燥的锥形瓶中，每个锥形瓶中分装培养基210 mL，经高压蒸汽灭菌后，向3个锥形瓶中分别加入宋内氏痢疾杆菌、金黄色葡萄球菌、铜绿假单胞菌菌液各10 mL，轻轻晃动使其混合均匀(菌液浓度约为104CFU/mL)，然后用无菌棉签沾取菌液在5 mm厚的琼脂平板上做均匀密集划线，用6 mm孔径打孔器打孔，每个培养皿中打3个孔，将每个浓度的供试药液滴入每个培养皿中的其中一个孔内，并做标记.每个培养皿中其余2个小孔中分别加入头孢噻肟钠做阳性对照，无菌水做阴性对照，约100 μL，然后将培养皿放置在37℃恒温箱中24 h后观察有无抑菌圈.

3 结果与分析

3.1 试管稀释法对重楼根茎愈伤组织提取物的抑菌作用

试管稀释法对重楼根茎愈伤组织提取物的抑菌作用实验结果如表1所示.

表1 试管稀释法的抑菌实验结果

由表1可知，重楼根茎愈伤组织提取物对宋内氏痢疾杆菌、金黄色葡萄球菌、铜绿假单胞菌均有不同程度的抑菌作用，其抑菌作用大小主要取决于所用提取物的浓度.重楼根茎愈伤组织提取物对宋内氏痢疾杆菌、金黄色葡萄球菌、铜绿假单胞菌的最小抑菌浓度分别为15.63 mg/mL、31.25 mg/mL、31.25 mg/mL.结果表明，重楼根茎愈伤组织提取物对宋内氏痢疾杆菌的抑菌作用较强，对金黄色葡萄球菌和铜绿假单胞菌的抑菌作用明显.

在无不当操作，无其他外界细菌的侵染条件下，试管里的液体培养基本身是清澈明亮的.实验培养一段时间后，如果培养基混浊，表示细菌生长，若培养基完全清亮，表示无细菌生长.同时，同种细菌在不同浓度的药液条件下浑浊程度不同.药物浓度越小，越浑浊.同种药物浓度不同细菌的条件下，培养基的浑浊程度也不同，反映了不同细菌抗药能力的不同.

实验中，试管培养基完全清亮的最大药液浓度即为该细菌的最小抑菌浓度(MIC).MIC值越大，说明重楼根茎愈伤组织提取物对该种细菌的抑菌作用越弱;反之，MIC值越小，说明提取物的抑菌作用越强.由重楼根茎愈伤组织提取物对3种细菌的最小抑菌浓度可以推测，重楼根茎愈伤组织提取物对宋内氏痢疾杆菌的抑菌作用强于金黄色葡萄球菌和铜绿假单胞菌.

实验中，不加药液的无菌水阴性对照组均出现浑浊，表示均有细菌生长，无菌水不起抑菌作用，消除干扰.不加药液只加头孢噻肟钠的阳性对照组均不出现浑浊，表示无细菌生长，头孢噻肟钠有很强的抑菌作用，可以此来对比提取液的抑菌效果.

3.2 琼脂平板扩散法对重楼根茎愈伤组织提取物的抑菌作用

琼脂平均法对重楼根茎愈伤组织提取物的抑菌作用如表2所示.

表2 琼脂平板扩散法的抑菌实验结果

由表2可知，高于MIC的药液浓度所对应的抑菌圈都很明显，而且药液浓度越高，抑菌圈直径越大，说明药液浓度与抑菌作用的高低成正相关.而低于MIC的药液浓度，由于其抑菌作用已经很微弱，其所对应的抑菌圈难以辨识.

由实验观察知，同一浓度的重楼根茎愈伤组织提取物对宋内氏痢疾杆菌的抑菌圈直径大于另2种细菌.由此可知，同药物浓度的条件下抑菌圈较大的，药物对对应的细菌抑菌作用更强，同时MIC值则较小;而抑菌圈小的，药物对对应的细菌抑菌作用则较弱，其MIC值就较大.

用无菌水做的阴性对照组，所有的实验细菌生长良好，无抑菌圈，即没有抑菌效果.由此证明，无菌水对细菌的影响很小，可以忽略.

用头孢噻肟钠溶液做的阳性对照，其抑菌圈最明显，抑菌效果最好.对比重楼根茎愈伤组织提取物与头孢噻肟钠溶液的抑菌效果强弱发现，重楼根茎愈伤组织提取物的抑菌效果不如头孢噻肟钠溶液的抑菌效果强.

4 结论

本研究以宋内氏痢疾杆菌、金黄色葡萄球菌和铜绿假单胞菌作为受试菌，对重楼根茎愈伤组织提取物的抑菌作用做了探讨，旨在探索重楼根茎愈伤组织提取物的最小抑菌浓度及其抑菌圈的特征.通过采用试管稀释法和琼脂平板扩散法对重楼根茎愈伤组织提取物进行的抑菌实验发现，重楼根茎愈伤组织提取物对宋内氏痢疾杆菌、金黄色葡萄球菌和铜绿假单胞菌的MIC分别为15.63 mg/mL、31.25 mg/mL、31.25 mg/mL，说明其对宋内氏痢疾杆菌、金黄色葡萄球菌和铜绿假单胞菌均有一定程度的抑菌作用，且对宋内氏痢疾杆菌的抑菌能力更强.该结果为以后进一步深入研究重楼愈伤组织药用价值提供了实验基础数据.

本实验采用无菌水作为阴性对照组，旨在说明无菌水无抑菌作用，因此无菌水对实验结果影响极小，可以忽略不计;用头孢噻肟钠溶液作为阳性对照组，旨在对比中草药与抗生素的抑菌作用大小.实验结果虽然表明相同浓度重楼根茎愈伤组织提取物的抑菌圈不如抗生素明显，但是仅从体外抑菌的实验效果去对比中药与抗生素在人体中抗感染的作用，这是不科学的.人体内部结构复杂，影响抑菌的方面现在尚未完全明了.所以，人们应该用全新的观点和方法去认识中药抗感染的临床疗效.中药抗感染的作用与单一的西药抗感染的作用不同，其中的重要一点就是能够增加机体的免疫功能.因此，研究和开发抗菌中药对解决耐药菌株的产生和抗生素短缺问题具有重要现实意义.

需说明的是，重楼根茎愈伤组织提取物在体外对宋内氏痢疾杆菌、金黄色葡萄球菌和铜绿假单胞菌都有一定的抑制作用，但是由于人体结构和机能的复杂性，其在体内是否仍具有抑菌作用以及抑菌作用的强弱还有待进一步研究.事实上，药物功能和作用机制的研究，归根到底是对于其不同阶段结构变化的研究.而结构决定功能，所以要想深入探究药物的作用机制，需要科研人员在分子水平上对药物、靶点及二者相互作用的结构进行阐述.此外，由于中药的组成成分复杂，对于在人体内是通过各个中药成分的靶向作用，还是通过相互化合产生一种新的化学物质来抑杀微生物，必须立足于中医基础理论，采用现代分子药理学及生物学的知识和方法来深入探索和研究中药.

［1］胡光万，雷立公.出自深山的良药—重楼［J］.植物杂志，2002，11(3):16.

［2］何含杰，章怀云，陈丽莉，等.重楼皂苷的药理作用和临床应用研究进展［J］.中药材，2014，37(3):527 －530.

［3］林逢春.滇重楼抑菌效果研究［J］.健康必读(下半月)，2010，1(6):141 －142.

［4］杨林.海河流域底泥中残留药物与个人护理品的检测及生态风险分析［D］.长沙:中南林业科技大学，2011.

［5］秦睿玲，徐占云，李春红，等.抗耐药菌中药的研究进展［J］.养禽与禽病防治，2010，29(3):2 －4.

Antimicrobial Effect of Paris Polyphylla Callus

LIU Yinhua1，2，WANG Yuehua2，HE Xinyou3，CHEN Yan3，TANG Xu1，2，MEI Ying2，HUANG Peng2
(1.College of Life Science，Sichuan Normal University，Chengdu 610101，China;2.School of Bioengineering，Chengdu University，Chengdu 610106，China;3.Sichuan Gold-land Chinese Medicinal Materials Planting Group Co.，Ltd.，Chengdu 611130，China)

This paper explores the antimicrobial action of callus from Paris polyphylla rhizome to provide an important way for effective development and utilization of chinese medicine resources.We used Shigella sonnei，Staphylococcus aureus and Pseudomonas aeruginosa as the tested bacteria，and took Cefotaxime Sodium as the contrast drug.We used the tube broth method and the agar plate diffusion method to research the antimicrobial action of the extract from Paris polyphylla rhizome callus，and compared the minimal inhibition concentrations of the three kinds of bacteria.The experimental results showed that the extract from Paris polyphylla rhizome callus had some antimicrobial effect，and the three minimal inhibition concentrations of Shigella sonnei，Staphylococcus aureus and Pseudomonas aeruginosa were 15.63 mg/mL，31.25 mg/mL and 31.25 mg/mL respectively.We conclude that the Paris polyphylla rhizome callus extract has some antimicrobial effect，which provides the experimental basis for its clinical application.

Paris polyphylla;callus;antimicrobial

R282.71;S567.23+9

A

1004－5422(2015)01－0012－04

2015－01－14.

四川省科技厅科技支撑计划(2014ZC2103)、成都市科技局科技计划(2014)资助项目.

刘银花(1990—)，女，硕士研究生，从事药用植物生物技术研究.