疑似结核患者T-SPOT.TB检测结果分析

雷红鸽 张敏 韩丰娟 闫小平

2000年全国结核病流行病学调查显示，全国受结核感染人数约为5.5亿人，其中传染性肺结核患者150万人［1］。结核菌素试验常用于结核感染的筛查，但因其假阳性率高，受卡介苗和机体免疫状态影响较大，使其应用受到限制，目前TST试验常用于3岁以下儿童结核感染的筛查。结核抗体和结核蛋白芯片是从血清学水平检查机体受结核菌感染情况，结核抗体检查体内总的抗体，而结核蛋白芯片同时可以检测五种结核菌特异抗体(CFP-10、ESAT-6、LAM、38 kD 和16 kD)，联合检测不仅可以提高其灵敏度，还可区分活动性感染和既往感染。由于结核杆菌感染机体后主要引起的细胞免疫，抗体产生的时间和量影响结核菌感染的早期诊断，同样受到机体免疫力的影响。而TSPOT-TB实验是从细胞免疫水平来检测结核菌感染，不受机体免疫和卡介苗的影响，采用结核菌特有的抗原ESAT-6和CFP-10作为靶抗原，有较高的灵敏度和特异性。我们用TSPOT-TB和结核蛋白芯片两种方法检测临床可疑结核患者236例，探讨两者在结核感染诊断中的敏感性和特异性，联合检测的临床应用价值。

1 资料与方法

1.1 一般资料 选取2014年1～7月我院住院疑诊或待排除结核患者236例，收集每位患者临床资料及结核病史、结核接触史、家庭史以及其他疾病史。其中男128例，女108例;年龄3～88岁，平均年龄48.68岁;最后确诊为结核患者共168例，其中肺结核为130例，痰涂片阳性7例，结核性胸膜炎为20例，结核性腹膜炎1例，肾结核1例，骨结核1例，淋巴结核4例，脊椎结核1例，附睾结核1例，结核性脑膜炎4例，膝关节结核1例，腰椎结核1例，胸椎结核1例，卵巢结核1例，髂关节结核1例。排除结核68例，肺部感染20例，支气管感染18例，肝硬化1例，淋巴结炎6例，甲状腺肿1例，间质性肺炎6例，心包积液1例，HIV感染1例，非结核感染性胸膜炎6例，肺癌1例，胸膜间皮瘤1例，布病1例，支原体肺炎2例，肠梗阻1例，脂肪肝1例，乙肝并发热1例。见表1。

表1 168例确诊结核患者临床资料表 例

1.2 方法

1.2.1 TSPOT.TB 检测:根据试剂盒(Oxford Immunotec，Oxford，UK)操作。肝素抗凝管采集外周静脉血5 ml，分离周血单个核细胞采用密度梯度离心法。在已包被抗IFN-γ抗体的微量板的4个孔中，分别加入阴性对照细胞培养液，阳性对照植物血凝素，A抗原(ESAT-6)和B抗原(CFP10)。然后每孔加入2.5×105浓度的外周血单个核细胞，轻混匀后放入5%的CO2培养箱中温育16～20 h，PBS洗板后，加入碱性磷酸酶标记的IFN-γ抗体4度孵育1 h，PBS洗脱，加入显色剂室温显色，PBS终止。采用放大镜人工计数每孔中的斑点数，阳性结果判断标准为:阴性对照孔中斑点数为0～5，抗原A和抗原B孔中斑点数-阴性对照孔中斑点数≥6;当阴性对照孔斑点数≥6时，抗原A和抗原B孔中斑点数≥2倍阴性对照孔斑点数。

1.2.2 结核蛋白芯片检测:采用生物微矩阵序列将结核五种特异抗原标记到芯片上(CFP-10、ESAT-6、LAM、38 kD和16 kD)，检测疑诊患者血清中相应的抗体。采集疑诊患者静脉血3 ml分离血清，按照蛋白质芯片操作要求进行操作，结果计算在蛋白芯片分析仪上完成。结果判断读如下:CFP-10和ESAT-6两者任一项阳性为活动性结核感染，LAM、38 kD和16 kD任两项阳性为结核菌感染，任何一项单独阳性结合临床，高度怀疑结核菌感染。

1.2.3 结核诊断:综合考虑临床表现、放射影像学、病原学以及抗结核治疗反应等最后作出肺结核和肺外结核的临床诊断。

1.2.4 评价指标:采用敏感性、特异性、阳性预测值、阴性预测值、阴性和阳性似然比作为统计学指标。

1.3 统计学分析 率的比较采用χ2检验，分析两种试验方法诊断效能的一致性用MeNeMar检验，一致性强度采用κ系数，P＜0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 结核蛋白芯片与T-SPOT.TBB诊断效能一致性分析 2种检验方法虽然总体检测结果阳性率差异有统计学意义(χ2=10.11，P＜0.01)，但一致性较弱(κ=0.192)。在结核患者中T-SPOT.TB各种诊断指标均高于结核蛋白芯片(χ2=30.7，P＜0.01)，两者的一致性为一般(κ=0.48)，在非结核患者中，T-SPOT.TB的诊断效验均显著高于结核蛋白芯片差异无统计学意义(P＞0.05)，两者一致性较差(κ =0.194)。见表2。

表2 结核蛋白芯片与T-SPOT.TB两种方法诊断效能分析表

2.2 结核蛋白芯片与T-SPOT.TB评价指标比较 TSPOT.T.B实验对结核的诊断敏感性为84.5%，特异性为92.6%，PPV 为 91.8%、NPV 为 72.7%，均高于结核蛋白芯片(P＜0.05);阳性似然比LR+为5.45，高于芯片1.13，阴性似然比 LR-为 0.09，明显低于结核蛋白芯片0.19，两者联合检测可以提高检测灵敏度(94.0%)和特异性(98.5%)。见表3。

表3 结核蛋白芯片与T.SPOT.TB检测评价指标 %

2.3 假阳性和假阴性患者临床特点 结核蛋白芯片主要检测结核感染患者体内特异性抗体，结核菌感染后主要为细胞免疫，体液免疫较弱，抗体产生的时间和量与机体免疫状态有关，38 kD和16 kD少数情况下受卡介苗的影响，当感染机体抵抗力低下或处于感染早期，就可能出现假阴性的结果;相反若近期接种过卡介苗(1例16 kD阳性)，或有其他病原体活动性感染(布氏杆菌感染导致38 kD阳性)以及肿瘤患者(2例LAM阳性)可以出现假阳性结果，但所有假阳性患者中无ESTA-6和CFP-10抗体阳性，说明这两项指标是结核分枝杆菌所特有，不受其他因素影响，且任何一项阳性均为活动性结核。T-SPOT.TB检测中出现假阳性5例，其中A抗原(ESAT-6)阳性3例，B抗原(CFP-10)阳性1例，1例两者均阳性，5例患者A、B抗原孔的斑点数均＜10，既往结核史2例，恶性肿瘤2例(胸膜间皮瘤和转移性肺癌)，1例慢性肝炎患者曾接受过干扰素抗病毒治疗。假阴性26例，平均年龄为68.5岁，外周血中淋巴细胞细胞绝对值低于1.0×109者为10例，分离的单个核细胞计数低于2.0×105者为5例，其余11例中有肺结核4例，淋巴结核2例，肾结核1例，腰椎结核1例，结核性脑膜炎1例，结核性胸膜炎2例。

2.4 肺结核和肺外结核患者T-SPOT.TB与结核蛋白芯片结果分析 T-SPOT.TB在肺结核患者中阳性率为89.2%(116/130)，肺外结核阳性率为 73.6%(26/38);结核蛋白芯片在肺结核阳性率为53.8%(70/130)，肺外结核阳性率为50%(19/38)。T-SPOT.TB实验在肺结核的诊断中明显高于结核蛋白芯片(P＜0.01)，在肺外结核的诊断中阳性率差别无统计学意义(P＞0.05)。

3 讨论

快速诊断和早期治疗结核是发展中国家结核防治的重点。由于我国卡介苗接种率高，TST假阳性率高［2］，结核蛋白芯片敏感性较低，特别是在免疫抑制人群中的低反应性限制了它们的应用。但结核蛋白芯片具有高通量，简便快速的特点，同时检测五种结核杆菌的特异性抗体(CFP-10、ESAT-6、LAM、38 kD 和16 kD)，五种抗体联合检测可以提高灵敏度和特异性。结核病原学诊断是金标准，但受标本中菌数量影响较大，且结核菌培养时间长，阳性率低，标本类型也受限制，不利于结核病的早期诊断和治疗。T-SPOT.TB实验方法与其他相比，有较高的灵敏度和特异性，结核感染患者外周血T淋巴细胞被RD1编码抗原活化后分泌IFN-γ，后者被微孔板上抗体结合，加酶和显色剂形成色素斑点，根据斑点数来判断结核感染情况，而正常人和非结核分枝杆菌感染患者外周血T淋巴细胞则不会被刺激产生 IFN-γ，因而理论上而言，TSPOT.TB试验对诊断结核感染应有较高的特异性。

本研究结果也显示，T-SPOT.TB诊断结核的敏感性(84.5%)与特异性(92.6%)均高于结核蛋白芯片的敏感性(53.0%)和特异性(83.8%);具有较高的阳性预测值(96.5%)，阴性预测值为70.8%，低于相关的报道［3］，表明T-SPOT.TB实验在结核的诊断中有重要作用，对结核的早期诊断起到一定作用。T-SPOT.TB试验的阳性似然比明显高于结核蛋白芯片，而阴性似然比明显低于结核蛋白芯片，提示T-SPOT.TB作为结核分枝杆菌感染的筛检方法是适合的，特别适用于疑难结核的诊断，它与结核蛋白芯片联合检测能提高结核感染诊断的灵敏度(94.0%)和特异性(98.5%)，阴性预测值达到84.1%阳性预测值为98.8%，正确率为(92.0%)，均高于两种方法单独检测的统计指标，灵敏度和阴性预测值有统计学意义(P＜0.05)，在临床可以将两者联合用于结核感染的筛检。

在肺外结核的诊断中，T-SPOT.TB实验的灵敏度和特异性均高于结核蛋白芯片，免疫抑制状态患者更需要对肺外结核作出早期迅速诊断，特别是使用免疫抑制剂人群的结核筛检，漏检会导致结核感染的活动或扩散，增加药物应用风险［4－6］。本研究显示，结核蛋白芯片假阴性率高均与免疫状态、高龄、严重疾病、自身免疫病有关，说明结核蛋白芯片在免疫抑制状态下易出现假阴性，敏感性较低，而T-SPOT.TB则补充了结核蛋白芯片的不足，更适合于接受免疫抑制剂治疗患者的结核筛查。有研究报道，严重肺结核患者对RD1肽段反应性低，对RD1肽段反应性高低与细菌抗原负荷相关［7－9］，本研究中10例假阴性患者的原因不明和阴性预测值低于相关文献资料，是否可以用此解释，尚需进一步研究。

虽然本研究显示，T-SPOT.TB对结核总体诊断有很高的特异性和灵敏感性，但随着研究样本数量的增大，在临床应用的深入，引起的假阴性的原因也增多，假阴性比例增加，阴性预测值会降低;同时不能区分活动性和隐匿性结核感染。而结核蛋白芯片虽然灵敏度和阴性预测值低，但可以区分活动性感染和隐匿性感染，本研究也显示两者联合检测可以增加灵敏度和特异度，阴性预测值和阳性预测值分别达到92.0%和98.5%，所以建议在临床上两者联合检测，降低假阴性率，提高结核感染的诊断率，同时可以提高活动性结核的检出率。

根据我院患者检测和临床资料，斑点数的多少与病情严重程度不相关，与活动性也不相关。我们统计T-SPOT.TB检测结果斑点数＞100的患者36例，血沉＞20 mm/h的为20例，斑点数的多少与血沉升高程度不相关;CRP＞25 ng/ml者有22例，斑点数多少与CRP值高低无相关性，血沉增加程度与CRP升高一致性较好(κ =0.69)，因此从目前研究来看，T-SPOT.TB作为对结核诊断有较高灵敏度和特异性的方法，正在普及临床应用，特别是对于免疫抑制剂使用的患者和免疫力低下人群结核筛查有重要意义，但斑点数的多少与结核感染活动性及严重程度的相关性需进一步探讨，需要更多的临床资料去证实和研究。

1 2000年全国结核病流行病学抽样调查报告.中国防痨杂志，2002，24:98-102.

2 Huebner RE，Schein MF，Bass JB.The tuberculin skin test.Clin Infect Dis，1993，17:968-975.

3 Chee CB，Gan SH，Khinmar KW，et al.Comparison of sensitivities of two clmmercial gamma interferon release assays for pulmonary tuberculosis.J Clin Microbiol，2008，46:1935-1946.

4 Kang YA，Lee HW，Hwang SS，et al.Usefulness of whole-blood interferon-r assay and interferon-r enxyme-linked immunospot assay in the diagnosis of active pulmonary tuberculosis.Chest，2007，132:959-965.

5 Kim SH，Choi SJ，Kim HB，et al.Diagnostic usefulness of a T-cell-based assay for extrapulmonary tuberculosis.Arch Intern Med，2007，167:2255-2259.

6 谢希，陈进伟，高洁生，等.结核感染T细胞斑点试验在结核诊断中的应用.临床内科杂志，2010，27:396-399.

7 Jiang W，Shao L，Zhang Y，et al.High-sensitive，and rapid detection of Myclbacterium tuberculosis jnfection by IFN-gamma release assay among HIV-infected individuals in BCG-vaccinated area.BMC Immunol，2009，10:31.

8 Goletti D，Butera O，Bixxoni F，et al.Region lf difference 1 antigen-specific CD4+memory T cells correlate with a favorable outcome or tuberculosis.J Infect Dis，2006，194:984-992.

9 Nicol MP，Pienaar D，Wood K，et al.Enzyme-linked immunospot assay responses to early secretory antigenic target 6，culture filtrate protein10，and purified protein derivative among children with tuberculosis implications for diagnosis and monitoring of therapy.Clin Infect Dis，2005，40:1301-1308.