响应面法优化解淀粉芽孢杆菌产细菌纤维素发酵条件

林伟铃,朱宏阳,饶雪娥,杨宏芳,李泳宁

(福建卫生职业技术学院药学系，福建福州 350101)



响应面法优化解淀粉芽孢杆菌产细菌纤维素发酵条件

林伟铃,朱宏阳*,饶雪娥,杨宏芳,李泳宁

(福建卫生职业技术学院药学系，福建福州 350101)

[目的] 实现高效生产细菌纤维素(Bacterialcellulose，BC)。 [方法]以解淀粉芽孢杆菌ZF-7(BacillusamyloliquefaciensZF-7)为菌源，通过单因素试验和中心组合试验原理设计响应面法(CCRD)对其发酵生产BC的发酵条件进行优化。[结果]利用单因素试验确定了最适碳源与氮源分别为D-葡萄糖和酵母膏，并确定了D-葡萄糖、酵母膏及无水乙醇添加量对BC产量(干重)的影响。响应面法优化得到的最佳发酵条件为：葡萄糖56.1 g/L、酵母提取物9.9 g/L、乙醇17.2 ml/L。在此条件下，测得BC产量7.88 g/L，比初始产量提高了35.4%。[结论] 研究可为解淀粉芽孢杆菌工业化应用提供参考。

细菌纤维素；解淀粉芽孢杆菌；响应面法；培养基优化

细菌纤维素(Bacterial Cellulose,BC)是1种由葡萄糖分子以β-1,4糖苷键聚合而成的天然纳米高分子材料，与植物纤维相比，细菌纤维素具有高结晶度，且其具有许多优良特性，如：良好的生物相容性、生物可降解性、较强的持水能力和较高的力学性能等[1]。因此，细菌纤维素在制药、食品、造纸和纺织等领域有着广泛的应用[2]。

目前用于细菌纤维素发酵生产的主要菌株有木醋杆菌(Acetobacterxylinum)[3]、汉逊氏葡糖酸醋杆菌(Gluconacetobacterhansenii)[4]、木葡萄糖酸醋杆菌(Gluconacetobacterxylinum)[5]或者解淀粉芽孢杆菌(Bacillusamyloliquefaciens)[6](80-84)。国内外许多学者对细菌纤维素的合成过程、细菌纤维素的理化特性及发酵条件的优化均做了大量的研究，并取得了一定的成果，为细菌纤维素的商业应用奠定了一定基础[7-9]。笔者在前期研究工作中，从自然界筛选得到一株高产BC的B.amyloliquefaciensZF-7[6](80-84)。为进一步提高其工业化应用潜力，笔者以B.amyloliquefaciensZF-7为BC出发菌株，以BC产量(干重)为响应值，采用单因素试验确定最适营养因素及添加量，并应用响应面分析方法优化发酵条件，以确定较优的发酵条件，实现高效生产BC。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 菌种。解淀粉芽孢杆菌(B.amyloliquefaciens)ZF-7，存于中国普通微生物菌种保藏中心，保藏号为CGMCC6266。

1.1.2 培养基。斜面培养基：葡萄糖20 g/L，蛋白胨20 g/L，牛肉膏5 g/L，柠檬酸5 g/L，Na2HPO4·12H2O 1 g/L，CaCO310 g/L，琼脂粉20 g/L，121 ℃灭20 min。

种子培养基：葡萄糖20 g/L，蛋白胨5 g/L，牛肉膏5 g/L，柠檬酸1 g/L，Na2HPO4·12H2O 5 g/L，121 ℃灭20 min。种子培养条件为30 ℃，100 r/min振荡培养24 h。

基本发酵培养基：葡萄糖50 g/L，牛肉膏8 g/L，调节pH至6.5，121 ℃灭20 min。接种前于超净台内向灭好菌的培养基内添加用灭菌滤头(0.22 μm)过滤的无水乙醇，终浓度为14 ml/L。发酵条件为30 ℃，静置培养5 d。

1.2 单因素试验

1.2.1 碳源对产BC的影响。分别考察50 g/L的甘油、葡萄糖、蔗糖、果糖、麦芽糖和菊粉水解物为碳源，其他成分与基本培养基相同，30 ℃，静置培养5 d后检测其湿重和干重，选出最佳碳源。并考察碳源浓度(20、30、40、50、60、80 g/L)对产BC的影响。

1.2.2 氮源对产BC的影响。选用最优碳源及浓度，分别用8 g/L的酵母膏、蛋白胨、牛肉膏、玉米浆、 (NH4)2SO4、NH4Cl等做氮源，其他条件同上，测定BC湿重及干重，选出最佳氮源。并考察氮源浓度(5、8、10、15、20 g/L)对产BC的影响。

1.2.3 无水乙醇对产BC的影响。分别考察不同浓度的无水乙醇(8、10、12、14、16、18 g/L)对产BC的影响，其他条件同上，测定BC湿重及干重选出最佳浓度。

1.3 响应面试验

由以上一系列试验结果可得出影响产BC的关键影响因子及其浓度，对其进行响应面优化，得出影响产BC的最佳培养基。

1.4 细胞浓度的检测

准确称取10 g湿膜并置于小烧杯中，加入活化好的纤维素酶液10 ml，浸泡一段时间然后滤除残渣，于波长660 nm测其吸光度。

1.5 细菌纤维素提取和处理方法

恒温静置培养5 d的细菌纤维素膜浮于表面，将膜取出后，用水多次冲洗，除去膜表面的培养基及杂质，将膜浸泡于1% (质量体积比)的NaOH溶液中，80 ℃恒温30 min，至膜呈乳白色半透明，然后用0.5%(体积分数)乙酸溶液浸泡，再用蒸馏水冲洗至pH中性，沥干表面水分，称湿质量，然后将纤维素膜于60 ℃烘箱烘至恒质量，称膜干质量。纤维素的产量以1 L培养基中纤维素的质量表示。

1.6 细菌纤维素产量和含水率的测定

将处理好的细菌纤维素凝胶于4 000 r/min离心30 min，所得膜定义为细菌纤维素湿质量；将纤维素凝胶于80 ℃干燥至恒质量，所得为细菌纤维素干质量。用精密电子天平称量细菌纤维素质量：

细菌纤维素凝胶含水率=(湿质量-干质量)/湿质量×100%

2 结果与分析

2.1 碳源对B.amyloliquefaciensZF-7产BC的影响

碳源是构成菌体成分的重要元素，是细胞内贮藏物质及微生物生长的主要能量来源，同时也是影响微生物分泌孢外产物的主要因素，碳源是合成BC的主要来源，同时还具有诱导或阻遏产物合成酶系的作用。试验分别考察了甘油、D-葡萄糖、蔗糖、D-果糖、麦芽糖和菊粉水解物为碳源，其他条件不变时对B.amyloliquefaciensZF-7的生长及产BC的影响，结果如表1所示。从表1中可以看出，在菌体生长方面，以甘油为碳源时，菌体生长最好，D-果糖次之，菊粉水解物第三；在BC产量(干重)方面，以D-葡萄糖为碳源时，BC产量达到最高值5.82 g/L，其次是以甘油为碳源，BC产量为4.81 g/L。因此选用D-葡萄糖作为碳源，并考察其添加浓度对菌体生长及产BC的影响，结果如表2所示。

表1 不同碳源对Bacillus amyloliquefaciens的生长及产BC的影响

从表2可以看出，D-葡萄糖浓度的提升在一定程度上有利于菌体的生长及BC产量的提高。当D-葡萄糖浓度升至40 g/L时菌体生长达到最大值。当D-葡萄糖浓度进一步提升至50 g/L时，菌体生长呈小幅下降趋势，而此时BC产量达到最高值5.92 g/L。当D-葡萄糖浓度为60 g/L时，菌体生长继续下降，BC产量也呈下降趋势。当D-葡萄糖浓度为80 g/L时，菌体生长被抑制，BC产量低于1 g/L，可能是由于高浓度的D-葡萄糖会抑制菌体生长而影响BC的合成。因此，选择50 g/L的D-葡萄糖为最适碳源浓度。

2.2 氮源对B.amyloliquefaciensZF-7产BC的影响

氮是构成微生物细胞中核酸和蛋白质的重要组成成分，对菌体的生长和代谢产物的合成有着重要的影响。试验考察了酵母膏、蛋白胨、牛肉膏、玉米浆、硫酸铵、氯化铵等对B.amyloliquefaciensZF-7的生长及产BC的影响，结果如表3所示。从表3中可以看出，以玉米浆为氮源时，菌体生长最好，以酵母膏为氮源时次之，牛肉膏为氮源时菌体生长居第三。对于BC的产量方面，则以酵母膏为氮源时最高，达6.81 g/L，而添加其他氮源时，BC产量均低于以酵母膏为氮源时的产量。此外，当添加无机氮源时，菌体生长受到抑制，OD660低于0.50，从而影响BC的合成。因此选择酵母膏为氮源，并考察其浓度对菌体生长及产BC的影响，结果如表4所示。

表2 葡萄糖添加量对B.amyloliquefaciens的生长及产BC的影响

从表4中可以看出，随着酵母膏添加量的提升，菌体生长也随之上升，而BC产量则先升后降，当发酵培养基中酵母膏的添加量为10 g/L时，BC产量达到最高值7.36 g/L，这可能是由于大部分碳源都被用于菌体生长而影响了产物的合成。因此，选择10 g/L的酵母膏为最适氮源浓度。

2.3 乙醇添加量对B.amyloliquefaciensZF-7产BC的影响

据文献报道，乙醇能够刺激BC的生产并显著提高BC的产量[10]。因此，试验考察了乙醇添加量对B.amyloliquefaciensZF-7的生长及产BC的影响。试验结果(表5)表明，随着乙醇浓度的增大，菌体生长呈下降趋势，这可能是乙醇浓度的上升抑制了菌体的生长。BC的产量在一定程度上随着乙醇添加量的增加呈上升趋势。当乙醇添加量为16 ml/L时，BC产量达到最大值7.64 g/L。

2.4 响应面优化发酵培养基组成

由以上一系列单因素条件试验结果可知，影响产BC的显著影响因子为D-葡萄糖、酵母膏及无水乙醇，以此3个因子为自变量，以ZF-7菌的菌体生长情况和BC产量为响应值，设计中心复合试验，各因子的试验水平及编码值见表6，试验设计及结果见表7。

表5 乙醇添加量对B.amyloliquefaciens ZF-7的生长及产BC的影响

表6 中心复合设计试验因素水平及编码

表7 中心组合试验设计及其结果

从该方程的分析可知，R2=0.950 5，这表明模型可以用来解释试验结果。同时，为了确定各因素的最佳值，对拟合方程求极值得：X1=56.1，X2=9.9，X3=17.2，代入回归方程得最大值Y=7.83 g/L。各因素相互作用图见图1。

比较回归方程的解，各因素的取值基本相近，为试验操作的方便，确定D-葡萄糖56.00 g/L，酵母膏10 g/L，无水乙醇17 ml/L，在该模型处做3次试验验证，得出BC产量为7.88 g/L。此结果与预测值相符，证实了模型有效性及存在着极大值点。预测培养基提高了BC产量，提高幅度为35.4%，因此具有指导意义。

3 结论

该研究通过对B.amyloliquefaciensZF-7产BC单因素试验，得出最适碳、氮源分别为D-葡萄糖与酵母膏，各因素的添加量为：D-葡萄糖50 g/L、酵母膏10 g/L、无水乙醇16 ml/L。在单因素试验的基础上，采用CCRD响应面软件优化发酵培养基，得到最佳条件为：D-葡萄糖56.1 g/L、酵母膏9.9 g/L、无水乙醇17.2 ml/L，在此条件下，预测BC产量为7.83 g/L。经试验验证，BC产量为7.88 g/L，与初始产量相比提高了35.4%。B.amyloliquefaciensZF-7是一株从自然环境中筛选得到的野生菌种，即使发酵培养条件进行了初步优化，但是仍不适合应用于工业化生产。后续研究将对该菌种进行诱变育种，以期筛选到适合工业化生产的诱变株。

[1] 邱俊,周绍龙.细菌纤维素的研究和应用新进展[J].中国美容医学,2011,20(5):870-873.

[2] 王银存,李立军,马英辉，等.细菌纤维素生产及应用研究进展[J].中国酿造,2011,4(4):20-23.

[3] 陆胜民,贾静静,杨颖.细菌纤维素发酵工艺与应用研究进展[J].食品与发酵科技，2011,47(1):27-31.

[4] 杨颖,贾静静,陆胜民,等.细菌纤维素高产菌株的鉴定及产物分析[J].中国食品学报，2012,12(7):216-221.

[5] SHODA M，SUGANO Y.Recent advance in bacterial cellulose production[J].Biotechnology and bioprocess engineering,2005,10(1):1-8.

[6] 朱宏阳,姚俊,冯珊，等.1株产细菌纤维素芽胞杆菌的分离及鉴定[J].生物加工过程，2014(5):80-84.

[7] 王银存,李利军,马英辉,等.细菌纤维素生产及应用研究进展[J].中国酿造,2011(4):20-23.

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[10] 张丽平,卢红梅,戴锐，等.乙醇及有机酸对木醋杆菌合成细菌纤维素的影响[J].食品工业科技，2014,35(4):161-169.

Optimization of Fermentation Conditions for Bacterial Cellulose Producing byBacillusamyloliquefaciensUsing Response Surface Methodology

LIN Wei-ling,ZHU Hong-yang*,RAO Xue-e et al

(Department of Pharmacy,Fujian Health College,Fuzhou,Fujian 350101)

[Objective] To realize high efficient production of bacterial cellulose(BC).[Method] The production of BC byBacillusamyloliquefaciensZF-7 was studied and the fermentation conditions were optimized.D-glucose and yeast extract were selected as the optimum carbon source and nitrogen source respectively.The effect of D-glucose,yeast extract and ethanol concentration on BC production was investigated by single factor methods.[Result] Based on the result of single factor experiments,the optimum conditions of fermentation were investigated by central composite design and response surface methodology.The results showed that the best conditions for BC fermentation were shown as follow:56.1 g/L of D-glucose,9.9 g/L of yeast extract and 17.2 ml/L ethanol.Under these conditions,the BC yield ofB.amyloliquefaciensZF-7 reached 7.88 g/L,which was increased by 35.4%as compared to the initial yield before the optimization.[Conclusion] The study can provide reference for industrial application ofBacillusamyloliquefaciens.

Bacterial cellulose;Bacillusamyloliquefaciens; Response surface analysis; Culture medium optimization

福建省教育厅A类科技项目(JA13414)；福建省教育厅B类科技项目(JB14205)。

林伟铃(1984- )，女，福建福州人，助理实验师，硕士，从事微生物遗传育种研究。*通讯作者，讲师，博士，从事微生物育种与发酵工艺研究。

2015-11-06

S 182

A

0517-6611(2015)35-142-03